RPA/RAA Plus/RT-RPA/RAA Plus 恒温扩增试剂说明书

规格及货号

储存及有效期

1. 本产品存储于25~30℃、干燥、避光条件下，有效期为12 个月；

2. 未用完试剂，请盖紧瓶盖置于常温保存，有效期2个月。

用途

本产品可应用于 多重核酸（DNA和/或RNA ）的快速扩增，根据需求选择产品及规格

产品说明

1. 本产品是“Ready to Use”即用型 RPA冻干颗粒；含有除引物、探针、模板和Mg2+外所有的反应要素：

重组酶，聚合酶，单链结合蛋白，ATP，dUTP，dATP，dCTP，dGTP，缓冲液，poly A，TET和PEG 35000等。

2. 本产品默认不配套Mg2+ ，推荐 醋酸镁 终浓度为14mM/Test;订购时请注明需配套醋酸镁.

3. 荧光型与基础型区别：

1) “基础型”适合电泳分析和后续CRISPR检测。★ 扩增产品电泳分析，请务必提取核酸；产品直接电泳，大概率观察不到条带。

2) “荧光型”含有外切酶或NFO适用荧光探针或试纸条，不适合后续电泳和CRISPR分析。

4. 核酸模板：

1) 提取后的DNA/RNA；

2) 核酸释放剂处理后的样本；

3) DNA 扩增片段和DNA 质粒，稀释时请务必避免污染。

5. 试剂盒最低检测限（LOD）： 10-100copies/测试（依据引物筛选优化程度和检测手段）。

6. 支持同时扩增4个靶点，即4重RPA。

技术原理

重组酶介导链置换核酸扩增（Recombinase Polymerase Amplification，RPA），是一种恒温核酸快速扩增技术。从细菌或真菌中获

得的重组酶在常温下可与引物DNA紧密结合，形成重组酶/引物复合体，侵入DNA双链核酸模板，在侵入位点重组酶将双链打开，同时

单链结合蛋白结合到被重组酶打开的单链上，维持双链模板处于开链状态。重组酶/引物复合体开始对双链进行扫描，当引物在模板上

搜索到与之完全匹配的互补序列时，重组酶/引物复合体解体，DNA聚合酶结合到引物的3’端，开始合成新链。合成的新链又可以作为

模板，最终扩增产物以指数级增长，完成靶标基因的扩增。经过荧光标记的探针与扩增产物结合，当探针被核酸内切酶酶切后，与生物

素标记的引物共同扩增形成两端有荧光标记及生物素标记的片段，可用电泳法或荧光法进行判断。

本试剂盒具有快速、灵敏度高以及特异性强等优点，反应组分已混合并冷冻干燥成核酸扩增试剂，操作简便，易于保存。

引物设计

引物及探针设计软件：推荐使用Beacon Designer 或 Oligo 7 设计引物及探针

引物探针的设计要求与常规PCR相比确实有所不同。以下是RPA引物探针设计的具体要求和建议：

1. 引物设计要求

1) 引物长度：建议的引物长度在28-35个核苷酸（nt）之间。

2) 序列特性：

引物序列中应避免回文序列、连续单碱基重复序列和内部二级结构区。

引物的Tm值（熔解温度）在RPA设计中不是主要考虑因素。

3) 筛选试验：

建议在进行RPA扩增反应之前，先进行引物的筛选试验，以便获得较高的检测灵敏度。

2. 探针设计要求

1) 探针长度：

建议的探针长度在46-52个核苷酸（nt）之间。

2) 序列特性：

探针序列中同样应避免回文序列、内部二级结构和连续的重复碱基。

探针内部可以包含碱基核苷酸类似物替换核苷酸（如四氢呋喃残基THF，有时称为'dSpacer'）以提高杂交稳定性。

3) 标记 (见图1)：

试纸条法：探针的5’端应使用一种抗原标记物进行标记，通常为FAM基团或羧基荧光素。

荧光法：探针THF上游和下游标记发光基团和淬灭基团。

探针的3’末端应包含聚合酶延伸阻断基团（如C3-spacer、磷酸基或双脱氧核苷酸），以防止非特异性延伸。

4) 注意事项

在开始实验前，请检查探针5’端标记的基团与下游引物5’端标记的基团是否与所用的试纸条或检测平台相匹配。

在开展RPA试纸条型扩增反应之前，进行引物的筛选试验，以优化检测灵敏度和特异性。

适用仪器

恒温金属浴、恒温水浴锅、荧光PCR仪、荧光RPA仪

检测步骤

1. 核酸样本处理：

1) 核酸提取：请参考传统DNA/RNA提取方法或其他同效商品化试剂盒提取DNA样本。

2) 核酸释放：请参照核酸释放剂说明书处理样本。

2. 推荐反应体系：

3. 操作步骤

1) 分装RPA 冻干球

根据需要实验反应数，将冻干球按1颗/Test 分装到反应管中。

2) 溶解冻干球：

加入21μL核酸、水或核酸释放剂溶解冻干球，至液体澄清。

*阴性对照：21μL无菌水或核酸释放剂等；

*阳性对照：21μL提取的核酸，核酸释放剂处理后的样本，DNA质粒等；

*若阳性对照体积不够，可以用水补齐剩余体积，操作过程避免交叉污染。

3) 根据实验需求将引物、探针和Mg2+ 制成混合液。

4) 取4μL 引物探针及Mg2+混合液滴于反应管盖上。

5) 盖紧管盖，上下颠倒混匀3-5次，瞬时离心后立即上机反应。

★6) 反应程序： 反应程序：42℃ 30 秒，共40循环。

结果分析与判定

1. 试纸条法：

1) 稀释液准备：准备200μL稀释液（试纸条推荐稀释液）备用。

2) RPA产物稀释：RPA扩增产物中加入200μL稀释液，混匀备用。

3) 免疫层析：取50~80μL稀释后的RPA产物，滴于试纸条上，待层析结束后观察条带。

2. 荧光法：

实验结束后，观察扩增曲线。RPA扩增曲线与PCR扩增曲线有明显差异，请注意适应。

3. 电泳法：

1) 扩增结束后，请用实验室确认可靠的核酸提取方案或商业化产品提取试剂纯化扩增产物。

2) 琼脂糖凝胶电泳或Page胶电泳分析。

注意事项

1. 开始实验前请仔细阅读本说明书全文，并严格按照要求进行操作。

2. 不同类型样品所提取的核酸含量和纯度有差异，可能导致扩增效率不同。

4. 当实验室环境、试剂、仪器或配件存在阳性物质（例如质粒、扩增产物等）污染，或样本间存在交叉污染的情况时，会影响检

测结果准确性，出现假阳性结果。

5. 务必保证试剂保存、配制或运输得当，否则可能导致试剂检测性能下降，出现假阴性结果。

6. 阳性对照为质粒，适用于评价本试剂核酸扩增性能。

7. 请严格按照基因扩增实验室的管理规范进行操作。 实验结束后，检测过程中所产生的废弃物应按照相关规范进行处理。

8. 实验过程遇到问题、或有不理解的实验结果、多重RPA的实验设计、引物及探针设计请联系技术支持。

9. RPA 常见问题及其他请联系供应商获取RPA 应用指南。

10. 使用本公司产品的客户，都享有每年1~2次去厂家现场实训的机会。

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