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Cat. Number
HA11984
Chemical Name
HA11984蛋白预制胶 Blue Native PAGE 4-13%, 10孔, 1.5mm(玻璃胶盒)
Qty 1
10片/盒
References

产品简介:

Blue Native PAGE(BN-PAGE)是一种从生物样品(质膜,胞浆等)中分离蛋白质复合物的电泳技术。能分离

10kDa-10MkDa 范围内的蛋白质以及蛋白质复合物。

BN-PAGE 以考马斯亮蓝G-250 代替SDS 使蛋白质复合物带负电荷,根据各个不同复合物分子量不同从而在胶

中得到分离。这些复合物在胶中以蓝色条带形式呈现。样品用一些温和的去污剂如dodecylmaltoside(DM),Triton

X-100 和毛地黄皂苷(digitonin)等溶解,从而使复合物以近似天然的状态分离。

实验中若想进一步分析复合物各个亚基的成分,通常采用BN-PAGE 结合SDS-PAGE 的方式。


基本信息:

胶板尺寸:宽×高×厚度为98×84×4.1mm;

凝胶尺寸为:宽×高×厚度为81×74×1.5mm;

丙烯酰胺与甲叉双丙烯酰胺的比例:29:1;

浓缩胶:4%,1.5cm;

凝胶厚度:1.5mm;

孔数:10 孔,15 孔;

最大上样量:60μL,30μL;

包装:10 片/盒。


使用说明:

1.样品处理

2.电泳

①将处理好的样品用微量进样器点在上样孔中

②倒入1X 阴极电泳液01 和1X 阳极电泳液

③插好电源,以恒压100V 开始电泳

④待样品跑过浓缩胶后,电压改为250V,之后可以慢慢增大,到样品最后跑完。控制电流在50mA 以内。

⑤待样品跑到凝胶的1/3 处更换阴极电泳液,将原来1X 阴极电泳液01 更换成1X 阴极电泳液02,这样可以

降低胶的背景。

3.固定和染色

当样品跑完整个凝胶后,剥胶,固定和染色。这个过程和普通的SDS-PAGE 一样。用固定液(20% ddH2O,40%甲醇,10%乙酸)固定30min 后,水洗4 次,15min 一次。然后在考染液中染色过夜。

4.脱色,扫描

染色过夜后,倒掉考染液,用双蒸水脱色,到背景十分干净为止,扫描。如果不要分析复合物各个亚基的组分,就可以直接拿Blue Native 胶切胶,酶解后质谱鉴定。若还想进一步分析复合物各个亚基的组成,则还要做二向SDS-PAGE。


二向SDS-PAGE 操作过程

1.制胶:根据实验需求选择合适浓度的SDS-PAGE

2.平衡:将BN 胶根据条带的位置切成长条,置于含有1%SDS,1%巯基乙醇溶液中平衡2h,水洗20min。

3.转移

先煮琼脂糖(0.05g 琼脂糖,10mL 电泳缓冲液,30μL 溴酚蓝),然后将平衡好的胶条摆在二向SDS 胶的浓缩胶胶面上,用压胶片把胶条压紧,使二者紧密结合,并保证两个胶面之间没有气泡,再向胶面上封一层琼脂糖。

4.跑胶

等琼脂糖凝固后,将玻璃板摆到电泳槽上,倒入电泳缓冲液,以25mA 恒流开始电泳。等样品跑过浓缩胶后,将电流改为45mA 直到电泳结束。

5.银染

①固定液(100mL 乙醇,25mL 乙酸,125mL 双蒸水)固定30min;

②将固定液倒掉,加入敏化液(0.5g 硫代硫酸钠,17g 乙酸钠,75mL 乙醇,最后定容至250mL)敏化30min;

③倒掉敏化液,加入双蒸水洗3 次,每次5min;

④倒掉水,加入银染液(0.625g 硝酸银加水至250mL)染色20min;

⑤倒掉染色液,水洗两次,每次1min;

⑥倒掉水,加入显影液(6.25g 碳酸钠,50μL 甲醛溶于250mL 水中),3-5min 以后即可看到结果;

⑦倒掉显影液,快速加入终止液(3.65g EDTA 溶于250mL 水中)终止20min;

⑧倒掉终止液,加入双蒸水洗胶面;

注意:每个步骤之间都要换干净手套,银染液配好后要避光。

6.扫描


产品保存和运输:

1.常温运输。

2.凝胶4-8℃贮存,可以存放2 个月。

3.请勿置于0℃以下,凝胶在0℃以下会冻凝,产生气泡和裂纹,凝胶报废。


拆胶:

1.先沿侧边胶处简单划一刀(或先将玻璃板侧边多余封胶材料去除);

2.用刀在侧边胶处,沿着玻璃板和玻璃条的缝隙切开封胶材料(箭头处),轻轻打开玻璃板;

3.取胶时,需在凝胶和两侧玻璃条之间沿着玻璃条划一刀,防止取胶时发生粘连使凝胶破碎。

BN1.png

注意事项:

1.样品处理是整个实验的关键,样品处理最重要的是去污剂的浓度以及去污剂和蛋白的比例,这个通常需要摸索,设置不同的浓度以及比例,最后选择最佳的。

2.上样量不能太大,太大样品会沉积在上样孔中不能下来。上样量是根据上样孔的大小以及胶的厚度来决定的。

3.样品的盐离子浓度要非常低,否则会导致样品在上样孔中沉积。如果样品的盐离子浓度很高,首先必须脱盐。

4.每个孔上样的样品体积不能超过上样孔容积的4/5,所以必须控制样品的浓度,浓度太低需浓缩。

5.所有操作必须在冰上进行,保证复合物的完整性。

6.仅限于专业人员的科学研究用,不得用于临床诊断或治疗,不得用于食品或药品,不得存放于普通住宅内。

7.为了您的安全和健康,请穿实验服并戴一次性手套操作。


玻璃胶盒兼容的电泳槽:

玻璃胶盒系列预制胶可以兼容大部分的mini SDS-PAGE 电泳槽,包括

a.Bio-Rad Mini-PROTEAN (II/3 /Tetra System)

b.Hoefer Mighty Small (SE 250/ SE 260/ SE 280)

c.Life Technology Novex Mini-Cell (请与万生昊天特制挡板配合使用)

d.北京六一DYCZ-25E、DYCZ-24K、DYCZ-24KS、DYCZ-24KF

e.君意东方JY-SCZ2+

f.天能VE180

g.或其它胶板宽度在10 厘米的电泳槽


在Life Technology Novex 电泳槽中的应用:

由于玻璃胶盒系列预制胶比Invitrogen NuPAGE 预制胶略薄,所以需要特制的挡板,使得该系列预制胶能够适用于Life Technology Novex 电泳槽。如有需要,请在订购本产品时告知。


在Bio-Rad 电泳槽中的应用:

Bio-Rad Mini-PROTEAN 系列电泳槽的U 型密封条顶部有突起结构,而万生昊天GLASS gel 系列预制胶的短玻板是凹形结构,因此该部位是平的,电泳前需将具有突起结构的密封条取出后反过来安装,是平滑面朝外,从而防止漏液(如下图所示)。另有厚度约为0.5mm 的塑料垫片,请根据您电泳槽的实际宽度进行相应的增加。

a.将Bio-Rad 电泳槽中的U 型密封条(如图绿色部分) 拉出,注意这时的密封条两端是有突起的,突起的这面为正面,无突起的为反面。

b.将密封条旋转180 度(正面朝里,反面朝外),重新装回电泳槽中,注意把密封圈周边压实,防止发生漏液。

c.放置好预制胶进行正常的电泳操作即可。

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