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| Cat. Number | HK21634-96S |
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| Chemical Name | HK21634-96S 转氢酶-2活性测试盒(酶标板法) |
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| Qty 1 |
100T/96S |
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| References | 线粒体转氢酶-2 (Mitochondrial hydrogenase-2, TH-2) 位于线粒体的内膜上，又称为线粒体复合体六，催化 NADH+ NADP+ 和 NAD++ NADPH 相互转化，调节线粒体 NAD(H) 和 NADP(H) 平衡。 把逆向反应称为 TH-2，催化 NADPH 和 NAD+ 生成 NADP+ 和 NADH。 测定原理： NADH和NADPH均在340nm有特征吸收，因此TH催化的转氢反应不能导致340nm吸光度发生变化。用人工合成底物3-乙酰吡啶腺嘌呤二核苷酸（APAD+）替代NAD+，TH-2催化APAD+还原生成APADH，APADH在375nm有特征光吸收，测定375nm光吸收的增加速率，来计算TH-2活性。 需自备的试剂和器材： 1.可见分光光度计/酶标仪 2.37℃恒温箱 3.系列可调节移液器及吸头，一次检测样品较多时，最好用多通道移液器 4.去离子水或蒸馏水 产品组成：
实验步骤： 一、样品处理 组织、细菌或细胞中胞浆蛋白与线粒体蛋白的分离 1. 准确称取 0.1g 组织或收集 500 万细胞，加入 1mL 试剂R1，用冰浴匀浆器或研钵匀浆。 2. 将匀浆液 600g，4℃离心 5min。 3. 弃沉淀，将上清液移至另一离心管中，11000g，4℃离心 10min。 4. 上清液即为除去线粒体的胞浆蛋白，可用于测定从线粒体泄漏的 TH-2(此步可选做)。 5. 步骤 4 中的沉淀即为线粒体，加入 500uL 试剂R2，超声波破碎(冰浴，功率 20% 或 200W， 超声 3s，间隔 10 秒，重复 30 次)，用于 TH-2 活性测定。 二、试剂准备 工作液的配制：临用前将试剂R4, R5 转移到 试剂R3中混合溶解，置于 37℃(哺乳动物)或25℃(其它物种)水浴 5min，现配现用； 三、测定步骤 1. 分光光度计/酶标仪预热 30 min 以上，调节波长到 375 nm，蒸馏水调零。 2. 在 微量石英比色皿或 96 孔板中按顺序加入下列试剂：
四、TH-2 含量计算 1. 用微量石英比色皿测定的计算公式如下 (1)按样本鲜重计算 单位的定义：每g 组织每分钟产生1 nmol APADH 定义为一个酶活性单位。 TH-2 活性 (nmol/min/g 鲜重) = [ΔA×V 反总÷(ε×d)×109]÷(W× V 样÷V 样总) ÷T (2)按样本蛋白浓度计算 单位的定义：每 mg 组织蛋白每分钟产生 1 nmol APADH 定义为一个酶活性单位。 TH-2 活性 (nmol/min /mg prot) = [ΔA×V 反总÷(ε×d)×109]÷(V 样×Cpr)÷T ※ 蛋白定量检测建议使用本公司：BCA 蛋白检测试剂盒 (3)按细菌或细胞密度计算 单位的定义：每1 万个细菌或细胞每分钟产生1 nmol APADH 定义为一个酶活性单位。 TH-2 活性 (nmol/min /104 cell) = [ΔA×V 反总÷(ε×d)×109]÷(500×V 样÷V 样总) ÷T V 反总：反应体系总体积； ε：APADH 摩尔消光系数，6.7×103 L / mol /cm； d：比 色皿光径，1cm； V 样：加入样本体积； V 样总：加入提取液体积； T：反应时 间，10min； Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL； W：样本质量，g； 500：细菌或细胞总数，500 万。 2. 用 96 孔板测定的计算公式如下 (1)按样本鲜重计算 单位的定义：每g 组织每分钟产生1 nmol APADH 定义为一个酶活性单位。 TH-2 活性 (nmol/min/g 鲜重) = [ΔA×V 反总÷(ε×d)×109]÷(W× V 样÷V 样总) ÷T (2)按样本蛋白浓度计算 单位的定义：每mg 组织蛋白每分钟产生1 nmol APADH 定义为一个酶活性单位。 TH-2 活性 (nmol/min/mg prot) = [ΔA×V 反总÷(ε×d)×109]÷(V 样×Cpr)÷T ※ 蛋白定量检测建议使用本公司：BCA 蛋白检测试剂盒 (3)按细菌或细胞密度计算 单位的定义：每1 万个细菌或细胞每分钟产生1 nmol APADH 定义为一个酶活性单位。 TH-2 活性 (nmol/min/104 cell) = [ΔA×V 反总÷(ε×d)×109]÷(500×V 样÷V 样总) ÷T V 反总：反应体系总体积； ε：APADH 摩尔消光系数，6.7×103 L / mol /cm； d：96 孔板光径，0.5cm； V 样：加入样本体积； V 样总：加入提取液体积； T： 反应时间，10 min； Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL； W：样本质量，g； 500：细菌或细胞总数，500 万。 本试剂盒仅供科研使用! |
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