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Cat. Number
HK21628-48S
Chemical Name
HK21628-48S 中性木聚糖酶测试盒(酶标板法)
Qty 1
100T/48S
References

木聚糖酶(EC 3.2.1.8)主要由微生物产生,能催化水解木聚糖,也被称为戊聚糖酶或半纤维素酶,可分解酿造或饲料工业中的原料细胞壁以及β-葡聚糖,降低酿造中物料的粘度,促进有效物质的释放,以及降低饲料中的非淀粉多糖,促进营养物质的吸收利用,因而广泛的应用于酿造和饲料工业中,中性木聚糖酶(NEX)一般分离自适生长pH为6-8的微生物。

测定原理:
    中性木聚糖酶(NEX)在中性环境中催化木聚糖降解成还原性寡糖和单糖,在沸水浴条件下进一步与3,5-二硝基水杨酸发生显色反应,在540nm处有特征吸收峰,反应液颜色的深浅与酶解产生的还原糖量成正比,通过测定反应液在540nm吸光值增加速率,可计算中性木聚糖酶(NEX)活力。


需要的仪器,耗材:

1、可见分光光度计/酶标仪

2、台式离心机

3、可调式移液器

4、微量石英比色皿/96孔板

5、研钵、冰和蒸馏水。


产品组成:

试剂名称规格保存条件
缓冲液液体x1瓶2-8℃
试剂R1液体x1瓶2-8℃
试剂R2液体x1瓶2-8℃
标准品粉剂x1支2-8℃


实验步骤:

一、样本处理(具体比例可以参考文献)

1、细胞或微生物样本发酵液的制备:发酵液于8000rpm,4℃,离心15min,取上清,置于冰上待测。

2、组织:称取约0.1g组织,加入1mL缓冲液,冰上充分研磨。8000g,4℃离心 15min,取上清,置冰上待测。

3、酶干粉:称约 1mg,加缓冲液 1mL,震荡充分溶解。

二、试剂准备

标准品:10mg木糖。临用前加入667uL 蒸馏水配成100umol/mL的标准品溶液,2-8℃保存两周。

三、测定步骤

1、可见分光光度计/酶标仪预热30min 以上,调节波长至540nm,可见分光光度计蒸馏水调零。

2、标准液

取20uL100umol/mL木糖标准液,加入480uL蒸馏水,充分混匀,配制成4umol/mL的木糖标准液备用,现用现配。

备注:实验中每管需要75uL,为减小实验误差,故配制大体积。

3、将上清液/酶溶液用蒸馏水稀释十倍后置冰上待测(即取50uL上清液/酶溶液,加入450uL蒸馏水,充分混匀)。

加入试剂对照管 测定管标准管空白管
样本(uL)5050
--
标准品(uL) --50-
蒸馏水(uL)---50
缓冲液(uL)75757575
试剂一(uL)-50
5050
混匀,盖紧瓶盖,50℃水浴,反应30min,立即沸水浴10min灭活。(注意不要让盖子爆开,以免进水,改变了反应体系)
试剂一(uL)50---
试剂二(uL) 75757575

混匀,沸水浴显色5min(注意不要让盖子爆开,以免进水改变了反应体系),冰浴冷却后吸取200uI至96孔板/比色皿中,尽快测量540nm波长下的吸光值A对照管、A测定管、A标准管、A空白管,计算ΔA测定=A测定管-A对照管,ΔA标准=A标准管-A空自管,空自管和标准管只需做1-2次。

四、NEX计算公式

1.发酵液 NEX 活力计算:

酶活定义:50℃,pH60条件下每毫升发酵液每分钟分解木聚糖产生1umo1还原糖所需的酶量为一个中性木聚糖酶的活力单位。

NEX活力(U/mL)=[ΔA测定÷(ΔA标准÷C标准)]÷T

2.酶干粉NEX 活力计算:

酶活定义:50℃,pH60条件下,每毫克酶每分钟分解木聚糖产生1umo1还原糖所需的酶量为一个中性木聚糖酶的活力单位。

NEX活力(U/mg)=[ΔA测定÷(ΔA标准÷C标准)]xV样本x10÷(V样本xW酶÷V提取)÷T

3.组织中NEX活力的计算

(1)按样本蛋白浓度计算:

酶活定义:50℃,pH60条件下,每mg组织蛋白每分钟分解木聚糖产生1umo1还原糖所需的酶量为一个中性木聚糖酶的活力单位。

NEX活力(U/mgprot)=[ΔA测定÷(ΔA标准÷C标准)]xV样本x10÷(V样本xCpr)÷T

(2)按样本质量计算:

酶活定义:50℃,pH60条件下,每g组织每分钟分解木聚糖产生1umo1还原糖所需的酶量为一个中性木聚糖酶的活力单位。

NEX活力(U/g质量)=[ΔA测定÷(ΔA标准÷C标准)]xV样本x10÷(V样本*W÷V提取)÷T

C标准:木糖标准溶液,4umol/mL;

V样本:加入的样本体积,0.05mL;

W酶:酶干粉的质量,mg;

T:反应时间,30min;

Cpr:样本蛋白浓度,mg/mL;

W:组织样本质量,g;

V提取:加入缓冲液的体积,1mL;

10:样本稀释倍数。


注意事项:

吸光度变化应该控制在0.01~1.5之间,否则加大样本量或稀释样本,注意计算公式中参与计算的稀释倍数要相应改变;也可以延长或者缩短反应时间。


本试剂盒仅供科研使用!


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