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Cat. Number
HK21592-48S
Chemical Name
HK21592-48S 植酸酶测试盒(酶标板法)
Qty 1
100T/48S
References

植酸酶(phytase)是催化植酸及其盐类水解为肌醇与磷酸(盐)的一类酶的总称,属磷酸单酯水解酶,它能将食品和饲料中植酸及其盐转化为可供有机体利用的有效磷,降低粪便中的磷含量,减轻对环境的污染,改善营养成分的吸收和利用,因此具有极其广泛的研究和应用价值。


测定原理:

在一定的环境条件下,植酸酶可以分解植酸钠(肌醇六磷酸+二钠)产生无机磷和肌醇衍生物,在酸性条件下,无机磷和钼酸铵显色剂发生反应,产生蓝色的钼蓝物质,其在 700nm 有特征吸收峰,通过测定无机磷的含量,可计算出植酸酶的活性。


需要的仪器,耗材:

1、可见分光光度计/酶标仪

2、低温离心机

3、水浴锅/恒温培养箱

4、可调式移液器

5、研钵/匀浆器/细胞超声破碎仪

6、浓硫酸

7、微量玻璃比色皿/96 孔板

8、冰和蒸馏水。


产品组成:

试剂名称规格保存条件
提取液液体x1瓶2-8℃
缓冲液液体x1瓶2-8℃
试剂R1粉剂x1瓶2-8℃
试剂R2液体x1瓶2-8℃
试剂R3液体x1瓶2-8℃
标准品液体x1支2-8℃



实验步骤:

注意:实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。

一、样本处理(具体比例可以参考文献)

组织:按照样本质量(g):提取液体积(mL)为1.5~10的比例(建议称取约0.1组织,加入1mL提取液)加入提取液,冰浴匀浆;4000g4℃离心 10min(若仍然浑浊,可延长离心时间),取上清置冰上待测。

2. 细菌或细胞样本:收集细菌或细胞到离心管内,离心后弃上清,按照细菌或细胞数量(104个):提取液体积(mL)为500~10001的比例(建议500万细菌或细胞加入1mL摄取液)加入提取液,超声波破碎细菌或细胞(冰浴,功率 200W,超声 3s,间隔 7s,总时间3min),4000g 4℃离心10min,取上清置冰上待测。

3. 培养液或其他液体:直接检测。若溶液浑浊则离心后取上清进行测定。

二、试剂准备

1. 试剂R1:临用前加入到缓冲液中(可吸取缓冲液到试剂一瓶中反复冲洗),充分震荡溶解,用不完的试剂 2-8℃可保存4周。

2. 试剂R2:临用前加入3.15mL蒸馏水充分溶解,再将枪头伸入液面下缓慢加入 0.85mL浓硫酸,2-8℃可保存4周。

3. 试剂R3:临用前加入20mL蒸馏水充分溶解,2-8℃可保存4周。。

4 工作液: 临目前根据测定数量将试剂R1:试剂R3 1mL:5mL(约40T)的比例混夕,配制后2-8可保存3天。

5. 标准品:5umol/mL 无机磷标准液。

三、测定步骤

1、可见分光光度计/酶标仪预热30min以上,调节波长至700nm,可见分光光度计用蒸馏水调零。

2、标准溶液的稀释:将5umol/mL无机磷标准液用蒸馏水稀释至5、3、1、0.5、0.25、0.125、0.0625、0.03125umol/mL备用。

3、标准溶液稀释可参考下表:

序号稀释前浓度(mg/mL) 标准液体积(uL)蒸馏水体积(uL)稀释后浓度(mg/mL)
151501003
25502001
312002000.5
40.52002000.25
50.252002000.125
60.1252002000.0625
70.06252002000.03125

备注:实验中每个标准管需50uL标准溶液。

4、在EP 管中按下表步骤加样:

试剂名称(uL)测定管对照管标准管空白管
样本5050--
标准溶液--50-
37℃水浴5min


--
试剂R1120---
37℃水浴30min,沸水浴10min



试剂R1
-120--
蒸馏水--120170
工作液150150150150

室温静置10min,8000g,室温离心10min,吸取200uL上清,于700nm处测定吸光值,分别记为A测定、A对照、A标准、A空白。分别计算AA测定-A对照A标准一A标准-A空白(标准曲线和空白管只需做1-2次,每个测定管需设置一个对照管)。

四、植酸酶活性的计算

1.标准曲线的绘制

根据标准管的浓度(x,umol/mL)和吸光度ΔA标准(y,A标准),建立标准曲线。根据标准曲线,将A(y,A)代入公式计算样本浓度(x,umol/mL)。

2.植酸酶活性计算

(1)按样本蛋白质浓度计算

单位定义:在37℃,pH5.5环境下,每mg组织蛋白每分钟在反应体系释放1umol无机磷为1个酶活力单位。

植酸酶活性(U/mgprot)=xxV样总÷(CprxV样总)÷T

(2)按样本质量计算

单位定义:在37℃,pH5.5环境下,每g组织每分钟在反应体系释放1umol无机磷为1个酶活力单位。

植酸酶活性(U/g质量)=xxV样总÷W÷T=x÷W÷30:(3)

(3)按细菌/细胞数量计算

单位定义:在37℃,pH5.5环境下,每104个细胞每分钟在反应体系释放1umol无机磷为1个酶活力单位。

植酸酶活性(U/104cell)=xxV样总÷细胞数量÷T

(4)按照液体样本体积计算

单位定义:在37℃,pH5.5环境下,每mL样本每分钟在反应体系释放1umol无机磷为1个酶活力单位。

植酸酶活性(U/mL)=xxV样÷V样÷T

V样:加入样本体积;

V样总:提取液体积;

Cpr:样本蛋白质浓度,mg/mL;

W:样本质量 g;

T:反应时间,30min;

细胞数量:以万计。



注意事项:

1.为防止沸水浴10min过程中水分散失,建议使用螺旋管或用封口膜给EP管缠口。

2.如果测定吸光值过低或接近空白,适当延长反应时间或加大样本量后,重新测定。如果A测定大于1.5或者ΔA超过检测范围,建议将样本用蒸馏水进行适当稀释后进行测定。注意同步修改计算公式。

3. 结果于40min内测定完毕。


本试剂盒仅供科研使用!

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