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Cat. Number
HK21589-48S
Chemical Name
HK21589-48S 脂肪酸合成酶(FAS)测试盒(紫外分光光度法)
Qty 1
50T/48S
References

脂肪酸合成酶(Fatty acid synthetase,FAS)是一种关于脂肪酸再生能力并起重要作用的限速酶。


测定原理:
脂肪酸合成酶通过催化丙二酰辅酶A、乙酰辅酶A和NADPH 生成长链脂肪酸和NADP+,NADPH 在340nm 条件下有特征吸收峰。通过检测340nm 条件下吸光值的下降速率,可以计算出FAS 活性。


需要的仪器,耗材:

1、紫外分光光度计

2、水浴锅/培养箱

3、超声波细胞破碎仪

4、低温离心机

5、可调式移液器

6、1mL石英比色皿

7、研钵/匀浆器

8、冰和蒸馏水。


产品组成:

试剂名称规格保存条件
提取液液体×1瓶2-8℃
试剂R1粉剂×2瓶-20℃
试剂R2粉剂×2瓶-20℃
试剂R3液体×1瓶2-8℃
试剂R4粉剂×2支-20℃


实验步骤:

注意:实验之前建议选择2-3 个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。

一、样本处理(具体比例可以参考文献)

1、细菌、细胞样本的制备:按照细胞数量(104 个): 提取液体积(mL)为500~1000 : 1 的比例(建议500万细胞加入1 mL 提取液),冰浴超声波破碎细胞(功率300W,超声3 秒,间隔9 秒,总时间5 min);于4℃,12000g 离心20 min,取上清液,置于冰上待测。

2、组织样本的制备:按照质量(g): 提取液体积(mL)为1: 5~10 的比例(建议称取约0.1 g 组织,加入1mL提取液)加入提取液,冰浴匀浆后于4℃,12000 g 离心20 min,取上清液,置于冰上待测。

3、血清(浆)等液体样本:直接测定

二、试剂准备

1、试剂R1:临用前取一支加入2.5 mL 试剂R3,充分溶解,用不完的试剂分装后-20℃保存,可以保存2 周,禁止反复冻融。

2、试剂R2:临用前取一支加入2.5 mL 试剂R3,充分溶解,用不完的试剂分装后-20℃保存,可以保存2 周,禁止反复冻融。

3、试剂R4:临用前取一支加入1.25 mL 试剂R3,充分溶解,用不完的试剂分装后-20℃保存,可以保存2 周,禁止反复冻融。

三、测定步骤

1、紫外分光光度计预热30 min 以上,调节波长至340 nm,蒸馏水调零。

2、试剂R3临用前置于37℃(哺乳动物)或者25℃(其他物种)保温15min。

3、加样表(在比色皿中加入下列试剂)

试剂名称
测定管空白管
上清液100-
蒸馏水-100
试剂R18080
试剂R28080
试剂R3700700
试剂R44040
迅速吹打混匀,记录第15s 的吸光值A1 测定(A1 空白),和1min15s 时的吸光值A2 测定(A2 空白),计算ΔA =(A1 测定-A2 测定)-(A1 空白-A2 空白)。

空白管只需测定1-2 次,如果样本数量过多也可以将试剂一到试剂四按上述比例混匀配制成工作液进行测定。

四、FAS 活性计算

a. 使用微量石英比色皿测定的计算公式

(1)按照蛋白浓度计算

单位定义:在37℃(哺乳动物)或25℃(其他物种)条件下,每毫克蛋白每分钟氧化1 nmol NADPH 为1 个酶活单位。

FAS (U/mg prot) =[ΔA÷(ε×d)×V 反总×109] ÷(Cpr×V 样)÷T

(2)按照样本质量计算

单位定义:在37℃(哺乳动物)或25℃(其他物种)条件下,每克组织每分钟氧化1 nmol NADPH 为1 个酶活单位。

FAS (U/g 质量) =[ΔA÷(ε×d)×V 反总×109]÷(W×V 样÷V 样总)÷T

(3)按细胞数量计算

单位定义:在37℃(哺乳动物)或25℃(其他物种)条件下,每104 个细胞每分钟氧化1 nmol NADPH 为1个酶活单位。

FAS (U/104 cell) =[ΔA÷(ε×d)×V 反总×109]÷(细胞数量×V 样÷V 样总)÷T

(4)按液体体积计算

单位定义:在37℃(哺乳动物)或25℃(其他物种)条件下,每毫升样本每分钟氧化1 nmol NADPH 为 1个酶活单位。

FAS (U/mL) =[ΔA÷(ε×d)×V 反总×109]÷V 样÷T

ε:NADPH 摩尔消光系数,6.22×103 L/mol/cm;

d:比色皿光径,1 cm;

V 反总:反应体系总体积;

Cpr:上清液蛋白质浓度,mg/mL;

W:样品质量,g;

V 样:加入反应体系中上清液体积;

V样总:提取液体积;

T:反应时间,1 min;

细胞数量:以万计。

b. 使用96 孔UV 板测定的计算公式

将上述计算公式中比色皿光径d-1 cm 变为d-0.6 cm 进行计算即可。


注意事项:

1、提取液中含有BSA(约2mg/mL),测定上清液蛋白浓度时需要减去提取液中蛋白浓度。

2、如果测定吸光值>1.5 或ΔA>0.5,建议用蒸馏水稀释样本后再进行测定,计算公式中乘稀释倍数。如果测定吸光值较小,建议加大样本量后再进行测定。


本试剂盒仅供科研使用!

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