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Cat. Number
HK21584-48S
Chemical Name
HK21584-48S 蔗糖酶测试盒(酶标板法)
Qty 1
100T/48S
References

蔗糖酶(EC 3.2.1.26)是碳水化合物消化吸收的关键酶之一,能够水解蔗糖变成相应的单糖而被机体吸收。


测定原理:
本试剂盒采用3.5-二硝基水杨酸法测定蔗糖酶催化产生的还原糖的含量,由此可得出蔗糖酶水解速度。其原理是3.5-二硝基水杨酸与还原糖共热被还原成棕红色的氨基化合物,在540nm处检测,在一定范围内还原糖的量和反应液的颜色深度成正比。此法操作简便、迅速、杂质干扰较小。


需要的仪器,耗材:

1、可见分光光度计/酶标仪

2、台式离心机

3、可调式移液器

4、微量石英比色皿/96孔板

5、研钵、冰和蒸馏水。


产品组成:

试剂名称规格保存条件
提取液液体×1瓶2-8℃
试剂R1液体×1瓶2-8℃
试剂R2粉剂×1支2-8℃
试剂R3液体×1瓶常温保存
标准品粉剂×1支2-8℃


实验步骤:

一、样品准备

按照组织质量(g):提取液体积(ml)为 1:5~10的比例(建议称取约 0.1g组织,加入 1ml提取液),进行冰浴匀浆。8000g 4℃离心 10min,取上清,置冰上待测。

二、试剂准备

试剂R2:用时加入 1ml蒸馏水充分溶解待用;用不完的试剂 4℃保存。

标准品:用时加入1 mL 蒸馏水充分溶解,制备10 mg/mL 葡萄糖标准溶液待用;用不完的试剂4℃保存一周。

三、测定

1、分光光度计或酶标仪预热30min以上,调节波长至 520nm,蒸馏水调零。

2、标准品的制备

将标准品用蒸馏水按梯度稀释。标准液稀释可参考下表:

序号稀释前浓度(mg/mL)标准液体积(µL)蒸馏水体积(µL)稀释后浓度(mg/mL)
110125
375
2.5
2101004002
310
754251.5
41050450
1
514001000.8
613002000.6
71200300
0.4
811004000.2
9-05000

3、样本测定

在 EP管中依次加入下列试剂:

试剂名称(μL)对照管测定管标准管
试剂R1151515
蒸馏水15

样本3030
标准品


30
试剂R2
1515
置于 25℃准确水浴 10min
试剂R3303030
混匀, 100℃水浴 10min左右(盖紧,防止水分散失),冷却至室温
蒸馏水210210210

混匀,取200μL 至微量玻璃比色皿或96 孔板中测定各管540nm 吸光值,ΔA=A 测定管-A 对照管。(每个测定管需设一个对照管)

注意:实验之前建议选择2-3 个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。

四、蔗糖酶活力计算

1. 标准曲线的建立:

以标准品的浓度为x 轴,540nm 下的吸光度(ΔA 标准)为y 轴,绘制标准曲线。根据标准曲线,将ΔA(y)带入公式中计算出x 值(mg/mL)。

2. 按照蛋白浓度计算:

单位定义:每mg 组织蛋白每分钟催化水解1μg 蔗糖定义为一个酶活力单位。

蔗糖酶活力(U/mg prot)=(1000×x×V1)÷(V1×Cpr)÷T

3. 按照样本质量计算:

单位定义:每g 组织每分钟催化水解1μg 蔗糖定义为一个酶活力单位。

蔗糖酶活力(U/g 质量)=(1000×x×V1)÷(W÷V2×V1)÷T

1000:1mg/mL=1000μg/mL;

V1:加入反应体系中样本体积;

V2:加入提取液体积;

T:反应时间,10min;

Cpr:样本蛋白质浓度,mg/mL;

W:样本质量,g。


注意事项:

当A 大于0.9 时,建议将样本用提取液稀释后进行测定。


本试剂盒仅供科研使用!


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