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Cat. Number
HK21571-48S
Chemical Name
HK21571-48S 游离脂肪酸含量(FFA)测试盒(酶标板法)
Qty 1
100T/48S
References

游离脂肪酸FFA既是脂肪水解的产物,又是脂肪合成的底物。血清中FFA的浓度与脂类代谢、糖代谢、内分泌功能有关。


测定原理:

FFA与铜离子结合形成脂肪酸铜盐,并溶于氯仿;利用铜试剂法测定铜离子含量,即可推算出游离脂肪酸含量。


需自备的仪器和用品:

研钵/匀浆器、冰、台式离心机、可调式移液枪、可见分光光度计/酶标仪、微量玻璃比色皿/96 孔板、一个50mL玻璃瓶、一个10mL 玻璃瓶、正庚烷、无水甲醇、氯仿(三氯甲烷)、无水乙醇和蒸馏水。


产品组成:

试剂名称规格保存条件
提取液液体×1 瓶2-8℃
试剂R1液体×1 瓶常温
试剂R2液体×1 瓶2-8℃
试剂R3粉剂×2 瓶2-8℃
标准品粉剂×1 支常温


实验步骤:

注意:实验之前建议选择2-3 个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。

一、样本处理(可适当调整待测样本量,具体比例可以参考文献)

1、血清中FFA 测定:将所取血液,室温静置1h 后,于4 ℃ 离心机3500 rpm 离心15min,取上层血清置于4℃冰箱保存,待测。

2、组织中FFA 含量测定:组织用生理盐水冲洗干净后,用吸水纸吸取表面水分,称取约0.1g,加入1 mL 提取液,匀浆后,8000rpm,4℃离心10min,取上清液,置冰上待测。

二、试剂准备

1、试剂R1:实验前一天,取一个玻璃瓶,按照正庚烷:无水甲醇:氯仿=24:1:25 的比例配置(自备),盖紧后混匀;

2、试剂R3:临用前每瓶加入13 mL 无水乙醇充分溶解,4℃可保存一周;

3、标准品:临用前把试剂转移到10 mL 玻璃瓶中,加入7.8 mL 氯仿充分溶解,即为5μmol/mL 的棕榈酸标准溶液,4℃保存。

三、操作步骤

1. 分光光度计预热30 min 以上,调节波长到550 nm,无水乙醇调零。

2. 试剂R2在37℃水浴中预热30 min 以上。

3. 标准品的稀释:将标准品用氯仿稀释成1、0.8、0.6、0.4、0.2、0.1、0.05μmol/mL。

4. 按下表在1.5mL 离心管中加入相应试剂

试剂名称(uL)对照管测定管空白管标准管
蒸馏水30---
样本-30--
氯仿----
标准品----
试剂R1
300300300300
试剂R2120120120120
                                                                                    充分振荡10min后,3000rpm,离心10min
上层溶液50505050
试剂R3200200200200

充分振荡2min 后,静置15min,取0.2mL 于微量玻璃比色皿/96 孔板中,在550 nm 下测吸光值,分别记为A 对照管、A 测定管、A 空白管、A 标准管。(对照管和空白管各只做1-2 管)

四、FFA 含量计算

1、标准曲线的绘制:以标准溶液的浓度为x轴,以ΔA标准(ΔA=A标准管-A空白管)为y轴,绘制标准曲线,得到方程y=kx+b。将ΔA(ΔA=A测定管-A对照管)带入方程得到x。

2、血清FFA含量:

FFA含量(μmol/L)=1000x

3、组织FFA含量:

(1) 按样本蛋白浓度计算

FFA含量(μmol/mg prot)=x×V样总÷(Cpr×V样总)

(2) 按样本质量计算

FFA含量(μmol/g 质量)=x×V样总÷W

V样总:上清液总体积;

Cpr:样本蛋白质浓度,mg/mL;

W:样本质量,g;

1000:单位换算系数,1L=1000mL。


注意事项:

1. 试剂R3配制应尽量晚配,可在操作到加入试剂R2时,再配制试剂R3。

2. 必须保证每管的震荡频率及时间一致。

3. 尽量在30min 内完成测量。

4. 上层溶液不可以直接加入到96孔板内,并且测完后要密封好再丢弃。

5. 因所用试剂多数为有机溶剂,同一支吸头多次吸取会造成体积不准确,建议更换吸头。

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