异柠檬酸裂解酶ICL(EC4.1.3.1)主要存在于植物和微生物中，油料作物种子在萌发过程中，通过乙醛酸循环及其他过程将脂肪转变成碳水化合物。ICL是乙醛酸循环的关键酶之一。

测定原理：
ICL催化异柠檬酸降解为乙醛酸和琥珀酸，乙醛酸和NADH在LDH的作用下生成乙醇和NAD，NADH在340nm下有特征吸收峰，监测340nm吸光度的减小速率可间接反应ICL活性。

需自备的仪器和用品：

紫外分光光度计/酶标仪、台式离心机、水浴锅、移液器、微量石英比色皿/96孔UV板、研钵/匀浆器、冰和蒸馏水。

产品组成：

实验步骤：

注意：实验之前建议选择2-3 个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。

一、样本处理（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献）

1、细菌或细胞处理：收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照每500 万细菌或细胞加入1mL 提取液，超声波破碎细菌或细胞（功率200W，超声3 秒，间隔10 秒，重复30 次），15000g，4℃，离心20 分钟，取上清，置冰上待测。

2、组织处理：称取约0.1g 组织，加入1mL 提取液进行冰浴匀浆；15000g，4℃，离心20 分钟，取上清，置冰上待测。

二、试剂准备

1、提取液：临用前将试剂R加入到提取液中，勿放于-20℃；

2、试剂R3：临用前每瓶加入2.5mL 蒸馏水，充分混匀待用；用不完的试剂-20℃分装保存2 周，避免反复冻融；

3、试剂R4：临用前每瓶加入5mL 蒸馏水，充分混匀待用；用不完的试剂-20℃分装保存2 周，避免反复冻融；

4、试剂R5：使用前需先离心。根据用量按照试剂R5：蒸馏水为1:8 的体积比例充分混匀，现用现配；

5、工作液配制：按试剂R1：试剂R2：试剂R3：试剂R：试剂5=29:35:42:42:3的比例将各试剂混合后备用（共151μL，1T的量），根据样本数量现用现配。

三、测定步骤

1. 紫外分光光度计/酶标仪预热30min以上，调节波长至340nm，蒸馏水调零。

2. 样本测定

将上述试剂按顺序加入微量石英比色皿/96 孔UV 板中，加试剂六的同时开始计时，在340nm 波长下记录10秒时的初始吸光度A1，比色后迅速将比色皿连同反应液一起放入37℃（哺乳动物）或25℃（其它物种）水浴中准确反应2 分钟（如果酶标仪有控温功能可以将温度设置为37℃或25℃）；迅速取出比色皿并擦干，340nm 下比色，记录2 分10 秒时的吸光度A2，计算ΔA=A1-A2。

四、ICL 活性计算

A．用微量石英比色皿测定的计算公式如下

1、组织中ICL活力的计算：

（1）按样本蛋白浓度计算：

单位的定义：每mg组织蛋白在反应体系中每分钟消耗1nmol的NADH定义为一个酶活力单位。

ICL（U/mg prot）=ΔA ÷（ε×d）×V反总×10⁹÷(V样本×Cpr) ÷T

（2）按样本质量计算：

单位的定义：每g组织在反应体系中每分钟消耗1nmol的NADH定义为一个酶活力单位。

ICL（U/g 质量）=ΔA ÷（ε×d）×V反总×10⁹÷(W÷V提取×V样本) ÷T

V反总：反应总体积；

V样本：加入样本体积；

ε：NADH摩尔消光系数，6.22×103L/mol/cm；

d：微量石英比色皿光径，1cm；

Cpr：样本蛋白浓度，mg/mL；

V提取：加入提取液体积；

W：样本质量，g；T：

反应时间，2min；

10⁹：单位换算系数，1mol=10⁹nmol。

2、细菌或培养细胞中ICL活力的计算：

（1）按样本蛋白浓度计算：

单位的定义：每mg组织蛋白在反应体系中每分钟消耗1nmol的NADH定义为一个酶活力单位。

ICL（U/mg prot）=ΔA ÷（ε×d）×V反总×10⁹÷(V样本×Cpr) ÷T

（2）按细菌或细胞数量计算：

单位的定义：每1万个细菌或细胞在反应体系中每分钟消耗1nmol的NADH定义为一个酶活力单位。

ICL（U/104 cell）=ΔA ÷（ε×d）×V反总×10⁹÷(500÷V提取×V样本) ÷T

V反总：反应总体积；

V样本：加入样本体积；

ε：NADH摩尔消光系数，6.22×10³L/mol/cm；

d：微量石英比色皿光径，1cm；

Cpr：样本蛋白浓度，mg/mL；

V提取：加入提取液体积；

500：细菌或细

胞数量，500万；

T：反应时间，2min；

10⁹：单位换算系数，1mol=10⁹nmol。

B. 用96孔板测定的计算公式如下

1、组织中ICL活力的计算：

（1）按样本蛋白浓度计算：

单位的定义：每mg组织蛋白在反应体系中每分钟消耗1nmol的NADH定义为一个酶活力单位。

ICL（U/mg prot）=ΔA ÷（ε×d）×V反总×10⁹÷(V样本×Cpr) ÷T

（2）按样本质量计算：

单位的定义：每g组织在反应体系中每分钟消耗1nmol的NADH定义为一个酶活力单位。

ICL（U/g 质量）=ΔA ÷（ε×d）×V反总×109÷(W÷V提取×V样本) ÷T

V反总：反应总体积；

V样本：加入样本体积；

ε：NADH摩尔消光系数，6.22×10³L/mol/cm；

d：96孔UV板光径，0.6cm；

Cpr：样本蛋白浓度，mg/mL；

V提取：加入提取液体积；

W：样本质量，g；

T：反应时间，2min；

10⁹：单位换算系数，1mol=10⁹nmol。

2、细菌或培养细胞中ICL活力的计算：

（1）按样本蛋白浓度计算：

单位的定义：每mg组织蛋白在反应体系中每分钟消耗1nmol的NADH定义为一个酶活力单位。

ICL（U/mg prot）=ΔA ÷（ε×d）×V反总×10⁹÷(V样本×Cpr) ÷T

（2）按细菌或细胞数量计算：

单位的定义：每1万个细菌或细胞在反应体系中每分钟消耗1nmol的NADH定义为一个酶活力单位。

ICL（U/104 cell）=ΔA ÷（ε×d）×V反总×10⁹÷(500÷V提取×V样本) ÷T

V反总：反应总体积；

V样本：加入样本体积；

ε：NADH摩尔消光系数，6.22×10³L/mol/cm；

d：96孔UV板光径，0.6cm；

Cpr：样本蛋白浓度，mg/mL；

V提取：加入提取液体积；

500：细菌或细胞数量，500万 ；

T：反应时间，2min；

10⁹：单位换算系数，1mol=10⁹nmol。

注意事项：

1、测定过程中样本和所有试剂在冰上放置，以免变性和失活。

2、比色皿中反应液的温度必须保持37℃或25℃，取小烧杯一只装入一定量的37℃或25℃蒸馏水，将此烧杯放入37℃或25℃水浴锅中。在反应过程中把比色皿连同反应液放在此烧杯中。96 孔UV 板测定时，不推荐同时测多个样本。

本试剂盒仅供科研使用!