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| Cat. Number | HK21565-24S |
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| Chemical Name | HK21565-24S 乙酰辅酶A羧化酶(ACC)测试盒(可见分光光度法) |
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| Qty 1 |
50T/24S |
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| References | 乙酰辅酶A羧化酶（Acetyl-CoA carboxylase，ACC）在生物体内催化乙酰辅酶A羧化生成丙二酰辅酶A，是脂肪酸和许多次生代谢产物合成的关键酶。ACC的活性在一定程度上决定了脂肪酸的合成速度和含油量的高低。 测定原理： ACC能够催化乙酰辅酶A、NaHCO3和ATP生成丙二酰辅酶A、ADP和无机磷，钼蓝与磷酸根生成660nm有特征吸收峰的物质，通过钼酸铵定磷法测定无机磷的增加量来测定ACC活性。 需自备的仪器和用品： 可见分光光度计、天平、低温离心机、微量玻璃比色皿/96 孔板、可调式移液枪、研钵/匀浆器、漩涡震荡仪、水浴锅、蒸馏水、冰盒、EP 管。 产品组成：
实验步骤： 注意：实验之前建议选择2-3 个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。 一、样本处理（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献） 1、组织：按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为1：5~10 的比例（建议称取约0.1g 组织，加入1mL 提取液）进行冰浴匀浆，然后，8000g，4℃，离心10min，取上清置于冰上待测。 2、细菌或细胞：收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照细菌或细胞数量（104 个）：按照细菌或细胞数量（104 个）：提取液体积（mL）为500~1000：1 的比例（建议500 万细胞加入1mL 提取液），冰浴超声波破碎细胞（功率300w，超声3 秒，间隔7 秒，总时间3min）；然后8000g，4℃，离心10min，取上清置于冰上待测。 3、血清（浆）：直接测定。 二、试剂准备 1．试剂R2：临用前将试剂R2B、试剂R2C 倒入试剂R2A，充分溶解待用；可分装后-20℃保存，避免反复冻融； 2．试剂R3：临用前加入6 mL 双蒸水，充分溶解待用；可分装后-20℃保存，避免反复冻融； 3．试剂R4：临用前加入15 mL 双蒸水，溶解后4℃保存一周； 4．试剂R5：临用前加入15 mL 双蒸水，溶解后4℃保存一周； 5．提取液的配制：按提取液1：提取液2= 990：10（V：V）的比例配制，根据样本量现配现用，禁止将提取液2一次性全部加入提取液1混匀分装待用； 6．标准品：10 μmol/mL 标准磷贮备液； 7．工作液（定磷剂）的配制：按H2O：试剂R4：试剂R5：试剂R6=2:1:1:1 的比例配制，配好的工作液应为浅黄色；若变色则试剂失效，若是蓝色则为磷污染，工作液应现配现用； 注意：配试剂最好用新的烧杯、玻璃棒和玻璃移液器，也可以用一次性塑料器皿，避免磷污染。 三、测定步骤 1、分光光度计预热30min 以上，调节波长至660nm，蒸馏水调零。 2、临用前将试剂R1、试剂R2、试剂R3在37℃（哺乳动物）或25℃（其它物种）预热10min。 3、将10μmol/mL 标准液用蒸馏水稀释为1.25、0.625、0.3125、0.15625、0.078μmol/mL 的标准溶液备用。 4、操作表： （1）酶促反应： 在1.5mL 离心管中依次加入下列试剂：
（2）定磷反应：
四、ACC 活性计算 1. 标准曲线的绘制： 以各个标准溶液的浓度为x 轴，其对应的ΔA 标准为y 轴，绘制标准曲线，得到标准方程y=kx+b，将ΔA 带入方程得到x（μmol/mL）。 2. 按蛋白浓度计算 酶活定义：每小时每毫克组织蛋白产生1μmol 无机磷的量为一个ACC 活力单位 ACC 酶活（U/mg prot）=x×V 总÷（V 样×Cpr）÷T 3. 按样本质量计算 酶活定义：每小时每g 组织产生1μmol 无机磷的量为一个ACC 活力单位。 ACC 酶活（U/g 质量）=x×V 总÷（V 样×W÷V 样总）÷T 4. 按照细菌或细胞数量计算 酶活定义：每小时每104 个细菌或细胞产生1μmol 无机磷的量为一个ACC 活力单位。 ACC 酶活（U/104 cell）=x×V 总÷（V 样×细胞数量（万个）÷V 样总）÷T 5. 按液体体积计算 酶活定义：每小时每mL 液体产生1μmol 无机磷的量为一个ACC 活力单位。 ACC 酶活（U/mL）=x×V 总÷V 样÷T V 总：酶促反应总体积； V 样：加入样本体积； V 样总：加入提取液体积； T：反应时间，0.5h； Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL，蛋白浓度自行测定； W：样本鲜重，g。 注意事项： 1、工作液（定磷剂）应现配现用，正常颜色为浅黄色，如有变色或变蓝则均为失效。 2、此法具有微量、灵敏、快速的特点。所以对测定所用试管或EP 管等试验器材均要求严格无磷。 3、显色结束后应立即检测。 4、当ΔA 大于1.5 时，建议将样本用提取液稀释后再进行测定。 5、由于提取液中含有蛋白（约1mg/mL），若需要测定样本的蛋白浓度，需要减去提取液本身的蛋白浓度。 |
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