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| Cat. Number | HK21564-96S |
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| Chemical Name | HK21564-96S 乙酰辅酶A测试盒(酶标板法) |
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| Qty 1 |
100T/96S |
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| References | 乙酰辅酶A广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中。是生物体能源物质代谢过程中产生的一种重要的中间代谢产物。在体内能源物质代谢中是一个枢纽性的物质。糖、脂肪、蛋白质三大营养物质通过乙酰辅酶A汇聚成一条共同的代谢通路-三羧酸循环和氧化磷酸化，经过这条通路彻底氧化生成二氧化碳和水，释放能量用于ATP合成。此外，乙酰辅酶A是合成脂肪酸，酮体，胆固醇及其衍生物等生理活性物质的前体物质。 测定原理： 苹果酸脱氢酶可催化苹果酸和NAD生成草酰乙酸和NADH。柠檬酸合酶可催化乙酰辅酶A和草酰乙酸生成柠檬酸和辅酶A。利用苹果酸脱氢酶和柠檬酸合酶的偶联反应，乙酰辅酶A含量和NADH的生成速率成正比，340nm下吸光值的上升速率反应了乙酰辅酶A含量的高低。 需自备的仪器和用品： 紫外分光光度计/酶标仪、天平、水浴锅/恒温培养箱、台式低温离心机、微量石英比色皿/96孔UV板、可调式移液枪、研钵/匀浆器、冰、蒸馏水。 产品组成：
实验步骤： 注意：实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。 一、样本处理（具体比例可以参考文献）: 1. 组织：建议称取约0.1g样本，加入0.99mL提取液1和0.01mL提取液2进行冰浴匀浆。于4℃，8000g 离心10min，取上清，置于冰上待测。 2. 细胞或细菌：建议取500万细胞或细菌加入0.99mL提取液1和 0.01mL提取液2，冰浴超声波破碎细胞或细菌（功率200w，超声3秒，间隔10秒，重复30次)，于4℃，8000g 离心10min，取上清，置于冰上待测。 3. 血清（浆）或其他液体：直接检测，若液体有浑浊则离心后测定。 二、试剂准备 1、试剂R1：临用前取1支先将液体甩离至管底，然后加入125uL试剂R4，充分溶解；用不完的试剂-20C分装保存2周，避免反复冻融； 2、试剂R2：临用前取1支先将液体甩离至管底，然后加入125uL试剂R4，充分溶解；用不完的试剂-20C分装保存2周，避免反复冻融； 3、试剂R3：临用前取1瓶试剂R3B加入12mL 试剂R3A，充分溶解；用不完的试剂-20℃分装保存2周，避免反复冻融； 4、工作液：临用前将试剂R1、R2和R3按照1:1:90的比例混合，根据样本量现配现用。 三、测定步骤 1.紫外分光光度计/酶标仪预热30min以上，调节波长至340nm，分光光度计蒸馏水调零。 2.将工作液37℃（哺乳动物）或25℃(其它物种）预热10min。 3.取50uL样本和205uL工作液至微量石英比色皿或96孔UV板，混匀，立即记录340nm处20s的吸光值A1和80s时的吸光值A2，计算△A=A2-A1。 四、乙酰辅酶A含量计算 A、使用微量石英比色皿测定 1.按样本质量计算 乙酰辅酶A含量(nmol/g质量）=(ΔA÷ε÷d)×V反×109÷V样xV提÷W×F 2.按照细胞数量计算 乙酰辅酶A含量(nmol/104 cell）=((ΔA÷ε÷d)xV反×109÷V样xV提÷500xF 3.按液体体积计算 乙酰辅酶A含量(nmol/mL)=(ΔA÷ε÷d)xV反×109÷V样×F ε： NADH摩尔消光系数，6.22×103L/mol/cm; d：比色皿光径，1cm； 10：单位换算系数，1mol=109nmol； V反：反应总体积； V样：加入样本上清体积； V提：加入提取液1和提取液2的总体积； W：样本质量，g； 500：细胞或细菌数量，500万； F：稀释倍数。 B、使用96孔UV板测定 将上述公式中的d-1cm改为d-0.6cm (96孔UV板光径）进行计算即可。 本试剂盒仅供科研使用! |
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