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| Cat. Number | HK21560-96S |
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| Chemical Name | HK21560-96S 乙酸激酶(ACK)测试盒(酶标板法) |
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| Qty 1 |
100T/96S |
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| References | 乙酸激酶ACK主要存在于微生物中，催化乙酸和ATP生成乙酰磷酸和ADP，是细菌碳代谢和能量代谢的关键酶，尤其是在古细菌甲烷合成代谢中起着中枢作用。 测定原理： （1）ACK催化乙酸钠和ATP生成乙酰磷酸和ADP，（2）丙酮酸激酶催化ADP和PEP生成ATP和丙酮酸，（3）乳酸脱氢酶催化丙酮酸和NADH生成乳酸和NAD+，（4）在340nm下测定NADH氧化生成NAD+速率，即可反映ACK活性。 需自备的仪器和用品： 台式离心机、紫外分光光度计/酶标仪、水浴锅、微量石英比色皿/96孔UV板、可调式移液枪、研钵/匀浆器、冰、蒸馏水。 产品组成：
实验步骤： 注意：实验之前建议选择2-3 个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。 一、样本处理（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献） 1、细菌或细胞处理： 收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照每500 万细菌或细胞加入1mL 提取液，超声波破碎细菌或细胞（功率20%，超声3 秒，间隔10 秒，重复30 次），15000g，4℃，离心20 分钟，取上清，置冰上待测。 2、组织处理： 称取约0.1g 组织，加入1mL 提取液进行冰浴匀浆；15000g，4℃，离心20 分钟，取上清，置冰上待测。 3、血清（浆）：直接检测。 二、试剂准备 1、提取液：临用前将试剂九加入到提取液中，并于4℃保存； 2、试剂R2：临用前每瓶加入1 mL 双蒸水，充分溶解待用。用不完的试剂仍4℃保存； 3、试剂R3：临用前每瓶加入1 mL 双蒸水，充分溶解待用；用不完的试剂-20℃保存； 4、试剂R4：临用前每瓶加入2 mL 双蒸水，充分溶解待用；用不完的试剂-20℃保存； 5、试剂R5：临用前每支加入0.5 mL 双蒸水，充分溶解待用；用不完的试剂-20℃保存； 6、试剂R6：液体置于试剂瓶内EP 管中。临用前根据样本量将试剂R6、蒸馏水按43:457（V:V）的比例配制备用，现用现配； 7、试剂R7：液体置于试剂瓶内EP 管中。临用前根据样本量将试剂R7、蒸馏水按1:9（V:V）的比例配制备用，现用现配； 8、试剂R8：临用前加入5 mL 双蒸水，充分溶解待用。用不完的试剂仍4℃保存； 9、工作液：吸取0.06 mL 试剂R2、0.2 mL 试剂R3、0.13 mL 试剂R4、0.04 mL 试剂R5、0.04 mL 试剂R6、0.04mL 试剂R7、0.2 mL 试剂R8混匀，也可根据比例现用现配，于冰上备用。 三、测定步骤 1、紫外分光光度计/酶标仪预热30min以上，调节波长至340nm，蒸馏水调零。 2、将试剂R1于37℃（哺乳动物）或25℃（其它物种）保温15min。 3、操作表：
将上述试剂按顺序加入微量石英比色皿/石英96孔板中，加样本的同时开始计时，在340nm波长下记录20 秒时的初始吸光度A1，准确反应3 分钟立刻 340nm 下比色，记录3分20秒时的吸光度A2，计算ΔA 测定=A 测定1-A测定2，ΔA 空白=A 空白1-A 空白2，计算ΔA=ΔA 测定-ΔA 空白。 四、ACK活力计算 A.用微量石英比色皿测定： 1. 按样本蛋白浓度计算： 单位的定义：每mg组织蛋白每分钟消耗1nmol的NADH定义为一个酶活力单位。 ACK（U/mg prot）=[ΔA×V反总÷(ε×d)×109]÷(Cpr×V样) ÷T 2. 按样本质量计算： 单位的定义：每g组织每分钟消耗1nmol的NADH定义为一个酶活力单位。 ACK（U/g 质量）=[ΔA×V反总÷(ε×d)×109]÷(V样÷V提取×W) ÷T 3. 按细菌或细胞数量计算： 单位的定义：每1万个细菌或细胞每分钟消耗1nmol的NADH定义为一个酶活力单位。 ACK（U/104 cell）=[ΔA×V反总÷(ε×d)×109]÷(V样÷V提取×500) ÷T 4. 按血清体积计算： 单位的定义：每mL血清（浆）中消耗1nmol的NADH定义为一个酶活力单位。 ACK（U/mL）=[ΔA×V反总÷(ε×d)×109]÷V样÷T V反总：反应体系总体积，2×10-4L； ε：NADH摩尔消光系数，6.22×103L/mol/cm； d：比色皿光径，1cm； V样：加入样本体积； V提取：加入提取液体积； T：反应时间，3min； Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL； W：样本质量，g； 500：细菌或细胞总数，500万； 109：单位换算系数，1mol=109nmol。 B.用96孔板测定： 将上述公式中的d-1cm改为d-0.6cm（96孔板光径）进行计算。 注意事项： 1、测定过程中样本和所有试剂在冰上放置，以免变性和失活。 2、反应液的温度必须保持37℃或25℃，比色皿测定时可取小烧杯一只装入一定量的37℃或25℃蒸馏水，将此烧杯放入37℃或25℃水浴锅中。在反应过程中把比色皿连同反应液放在此烧杯中。 3、ΔA大于1时，建议稀释后测量，注意计算公式乘以稀释倍数；ΔA小于0.01时，建议延长反应时间测量，注意计算公式变化。 本试剂盒仅供科研使用! |
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