HK21550-96S 氧化型谷胱甘肽(GSSG)含量测试盒(酶标板法)_上海惠诚生物生物试剂,标准品,仪器设备,耗材,一站式服务

利用谷胱甘肽能和5,5'-二硫代-双-(2-硝基苯甲酸)(5,5'-dithiobis-2-nitrobenoic acid，DTNB)反应产生2-硝基-5-巯基苯甲酸，2-硝基-5-巯基苯甲酸在波长412nm处具有最大光吸收的特点，通过2-乙烯吡啶抑制样本中原有的还原型谷胱甘肽，然后利用谷胱甘肽还原酶将GSSG还原为GSH，借此测定氧化型谷胱甘肽的含量。

需自备的仪器和用品：

分析天平、匀浆器/研钵、低温离心机、水浴锅、移液器、可见分光光度计/酶标仪、微量玻璃比色皿/96孔板。

产品组成：

试剂名称	规格	保存条件
试剂R1	液体×1 瓶	2-8℃
试剂R2	液体×1 瓶	2-8℃
试剂R3	液体×1 瓶	2-8℃
试剂R4	液体×1 瓶	2-8℃
试剂R5	粉剂×1 瓶	2-8℃
试剂R6	液体×1 瓶	2-8℃
标准品	粉剂×1 支	2-8℃

实验步骤：

注意：实验之前建议选择2-3 个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。

一、样本处理（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献）

（1）组织处理

新鲜组织首先用PBS 冲洗2 次，然后称取动物组织或者植物组织0.1g。加入用试剂R1润洗过的匀浆器中（匀浆器提前放冰上预冷）；然后加入1mL 试剂R1（组织/试剂R1比例保持不变即可），迅速冰上充分研磨（使用液氮研磨效果更好）；8000g，4℃离心10min；取上清液放置于4℃待测，若暂时不能完成测试可放于-80℃保存（可保存10 天）。

（2）血液处理

血浆：将收集的抗凝血于4℃，600g 离心10 分钟，吸取上层血浆到另一支试管中，加入等体积的试剂R1，4℃，8000g离心10 分钟，将上清移入新的试管中放置于4℃待测，若暂时不能完成测试可放于-80℃保存（可保存10 天）。

血细胞：将收集的抗凝血于4℃，600g 离心10 分钟，弃去上层血浆用3 倍体积的PBS 清洗3 次（用PBS 重悬血细胞，600g 离心10 分钟），加入等体积试剂R1，混匀后4℃放置10 分钟，8000g 离心10 分钟，吸取上清放于4℃待测，若暂时不能完成测试可放于-80℃保存（可保存10 天）。

（3）细胞处理

收集不少于500 万个细胞，首先用PBS 清洗细胞2 次（PBS 重悬细胞，600g 离心10 分钟），加入1mL 试剂R1重悬细胞，反复冻融2-3 次（可在液氮中冻结，37℃水浴中溶解）或者进行超声（200W，超3s，停10s，重复30次），8000g 离心10 分钟，收集上清于4℃待测，若暂时不能完成测试可放于-80℃保存（可保存10 天）。

二、试剂准备

1、试剂R2：有毒易挥发试剂，涉及该试剂的步骤建议在通风橱内操作。

2、试剂R5：临用前加入2.5 mL 蒸馏水，溶解后-20℃分装保存；

3、试剂R6：液体置于试剂瓶内EP 管中。临用前根据样本量将试剂R6、蒸馏水按1:20（V:V）的比例配制备用，现用现配；

4、标准品：用1 mL 蒸馏水溶解，浓度为10 mg/mL，4℃保存。

三、测定步骤

1、分光光度计或酶标仪预热30min 以上，调节波长至412nm，分光光度计蒸馏水调零。

2、试剂R2放置37℃（哺乳动物）或25℃（一般物种）水浴中保温30min。

3、标准品的稀释：取适当溶液配制浓度为125μg/mL、62.5μg/mL、31.25μg/mL、15.625μg/mL、7.8125μg/mL、3.90625μg/mL、0μg/mL 的标准品（试剂R1十倍稀释后进行稀释）。

4、取0.5mL 离心管，加入20μL 稀释好的标准品或样本，加入1μL 试剂R2，混匀后37℃孵育30 分钟。

5、测定表：在0.5mL 离心管中依次加入

试剂名称(uL)	标准管	测定管
稀释好的标准品	20	-
样本	-	20
试剂R2	1	1
混匀后37℃孵育30 分钟
试剂R3	140	140
试剂R4	20	20
试剂R5	20	20
试剂R6	2	2
标准管：加入试剂R6即开始计时，迅速混匀后，测定412nm 处30s 和150s 光吸收A1 和A2，计算ΔA标准=A2-A1。
测定管：加入试剂六即开始计时，迅速混匀后，测定412nm 处30s 和150s 光吸收A1 和A2，ΔA 测定= A2-A1。