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| Cat. Number | HK21537-12S |
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| Chemical Name | HK21537-12S 线粒体呼吸链复合体Ⅴ活性测试盒(可见分光光度法) |
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| Qty 1 |
25T/12S |
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| References | 线粒体复合体Ⅴ又称F1F0-ATP合酶，广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞的线粒体中，由F1和F0两个亚单位组成。该酶利用呼吸链产生的质子电化学梯度催化ATP合成，也可逆过程水解ATP。此外，复合体Ⅴ还存在于叶绿体、异养菌和光合细菌中。复合体Ⅴ是线粒体氧化磷酸化和叶绿体光合磷酸化合成ATP的关键酶。 测定原理： 复合体Ⅴ水解ATP产生ADP和Pi，通过测定Pi增加速率来测定复合体Ⅴ活性。 需自备的仪器和用品： 台式离心机、可见分光光度计/酶标仪、水浴锅、微量玻璃比色皿/96 孔板、可调式移液枪、研钵/匀浆器、冰和蒸馏水。 产品组成：
实验步骤： 注意：实验之前建议选择2-3 个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。 一、样本处理（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献） 1. 称取约0.1g 组织或收集500 万细胞，加入1.0 mL 提取液，用冰浴匀浆器或研钵匀浆。 2. 4 ℃ 600g 离心10min。 3. 将上清液移至另一离心管中，4 ℃ 11000g 离心15min。 4. 上清液即胞浆提取物，可用于测定从线粒体泄漏的复合体Ⅴ（此步可选做，可以判断线粒体提取效果）。 5. 在沉淀中加入600μL 试剂R1，超声波破碎（功率20%，超声5 秒，间隔10 秒，重复12 次），用于复合体Ⅴ酶活性测定，并且用于蛋白含量测定。 二、试剂准备 1. 试剂R2：临用前每支加入1.11 mL 双蒸水，充分溶解备用，分装后-20℃保存，避免反复冻融； 2. 试剂R4：临用前加入3 mL 双蒸水，充分混匀； 3. 试剂R5：临用前加入10 mL 双蒸水，充分混匀； 4. 试剂R6：临用前加入10 mL 双蒸水，充分混匀； 5. 标准品：10 μmol/mL 磷标液，临用前用蒸馏水稀释40 倍即0.25 μmol/mL 磷标准液。 6. 定磷试剂的配制：按H2O：试剂R5：试剂R6：试剂R7=2:1:1:1 的比例配制，配好的定磷试剂应为浅黄色。 若无色则试剂失效，若是蓝色则为磷污染（请根据需要，用多少配多少）。 注意：配试剂最好用新的烧杯、玻璃棒和玻璃移液器，或者一次性塑料器皿，以避免磷污染。 三、测定步骤 1．可见分光光度计/酶标仪预热30min 以上，调节波长至660nm，蒸馏水调零。 2．样本测定： (1) 酶促反应
(2) 定磷
混匀，40℃水浴10min，尽快在660nm 测定吸光值，分别记为A 对照管、A 测定管、A 标准管、A 空白管，计算ΔA 测定=A 测定管-A 对照管，ΔA 标准=A 标准管-A 空白管。 四、复合体Ⅴ活性计算 单位的定义：每mg 组织蛋白在反应体系中每分钟产生1 nmol 无机磷定义为一个酶活性单位。 复合体Ⅴ活性（U/mg prot）=ΔA 测定÷ΔA 标准×C 标准×V 酶促×1000÷（Cpr×V 样本）÷T C 标准：标准溶液浓度； 1000：单位换算系数，1μmol=1000nmol； Cpr：样本蛋白浓度，mg/mL，需自行测定； V 样本：样本体积； V 酶促：酶促反应总体积； T：反应时间，30min。 注意事项： 1. 为保证实验结果的准确性，需先取1-2 个样做预实验，如果测定的吸光值过高（高于1），可用蒸馏水稀释上清液后再测定。计算结果时注意乘以稀释倍数。 2. 由于提取液中含有蛋白（约1mg/mL），所以在测定样本蛋白浓度时需要减去提取液本身的蛋白含量(单独测定)。 3. 测定胞浆时，定磷后反应液可能会有絮凝产生，测定前混合均匀即可，并不影响测定结果。 4. 推荐使用样本蛋白浓度计算酶活，若用样本质量计算，则需加测胞浆提取物酶活，上清和沉淀酶活之和方为总酶活。 5. 本试剂盒试剂足够完成100 管反应。 6. 附:使用样本重量计算公式：（样本检测数为50T/12S） A、上清中复合体Ⅴ活力的计算： 单位的定义：每g 组织在反应体系中每分钟产生1nmol 无机磷定义为一个酶活性单位。 复合体Ⅴ活性（U/g 质量）=ΔA1÷ΔA 标准×C 标准×V 酶促×1000÷(W÷V 提取×V 样本)）÷T ΔA1：上清测定值； C 标准：标准溶液浓度； 1000：单位换算系数，1μmol=1000nmol； V 提取：加入提取液体积； V 样本：样本体积； V 酶促：酶促反应总体积； T：反应时间，30min。 B、沉淀中复合体Ⅴ活力的计算： 单位的定义：每g 组织在反应体系中每分钟产生1 nmol 无机磷定义为一个酶活性单位。 复合体Ⅴ活性（U/g 质量）=ΔA2÷ΔA 标准×C 标准×V 酶促×1000÷(W÷V 提取×V 样本)）÷T ΔA2：沉淀测定值； C 标准：标准溶液浓度； 1000：单位换算系数，1μmol=1000nmol； V 提取：沉淀重悬体积； V 样本：样本体积； V 酶促：酶促反应总体积； T：反应时间，30min。 C、样本复合体Ⅴ总活力的计算： 样本复合体Ⅴ总活力即为上清中复合体Ⅴ活力与沉淀中复合体Ⅴ活力之和。 按样本质量计算：复合体Ⅴ（U/g 质量）=20×ΔA1÷ΔA 标准÷W+12×ΔA2÷ΔA 标准÷W 本试剂盒仅供科研使用! |
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