HK21535-24S 线粒体呼吸链复合体Ⅳ活性测试盒(可见分光光度法)_上海惠诚生物生物试剂,标准品,仪器设备,耗材,一站式服务

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Cat. Number

HK21535-24S

Chemical Name

HK21535-24S 线粒体呼吸链复合体Ⅳ活性测试盒(可见分光光度法)

Qty 1

25T/24S

References

线粒体复合体Ⅳ又称细胞色素C氧化酶，也是线粒体呼吸电子传递链主路和支路的共有成分，负责催化还原型细胞色素C的氧化，并终把电子传递给氧，生成水。

测定原理：
还原型细胞色素C在550nm有特征光吸收，线粒体复合体Ⅳ催化还原型细胞色素C生成氧化型细胞色素C，因此550nm光吸收下降速率能够反映线粒体复合体Ⅳ酶活性。

需自备的仪器和用品：

可见分光光度计、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、1mL玻璃比色皿、研钵/匀浆器、冰和蒸馏水。

产品组成：

试剂名称	规格	保存条件
提取液	液体×1瓶	2-8℃
试剂R1	液体×1瓶	2-8℃
试剂R2	粉剂×1支	-20℃
试剂R3	粉剂×1支	2-8℃

实验步骤：

注意：实验之前建议选择2-3 个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。

一、样本处理（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献）

1. 称取约0.1g 组织或收集500 万细胞，加入1.0 mL 提取液，用冰浴匀浆器或研钵匀浆。4 ℃ 600g 离心10min。

2. 将上清液移至另一离心管中，4 ℃ 11000g 离心15min。

3. 上清液即胞浆提取物，可用于测定从线粒体泄漏的复合体Ⅳ（此步可选做，可以判断线粒体提取效果）。

4. 在沉淀中加入400uL 提取液，超声波破碎（功率20%，超声5 秒，间隔10 秒，重复15 次），用于复合体Ⅳ酶活性测定，并且用于蛋白含量测定。

二、试剂准备

工作液的配制：临用前取试剂R1、试剂R2、试剂R3，将试剂R2和试剂R3依次转移到试剂一中混合溶解。

三、测定步骤

1、可见分光光度计预热30min以上，调节波长至550nm，蒸馏水调零。

2、将工作液置于37℃（哺乳动物）或25℃（其它物种）孵育15min；用不完的试剂4℃可保存一周；

3、样本测定（在微量玻璃比色皿/96孔板中分别加入）

试剂名称(uL)	测定管	空白管
样本	40	-
蒸馏水	-	40
工作液	800	800

立即混匀，分别记录测定管和空白管550nm 处初始吸光值A1 和1min 后的吸光值A2，测定管的记为A1 测定管，A2 测定管，空白管的记为A1 空白管，A2 空白管。计算ΔA1=A1 测定管-A2 测定管，ΔA2=A1 空白管-A2空白管，ΔA=ΔA1-ΔA2。

四、复合体Ⅳ活力单位的计算

按样本蛋白浓度计算

单位的定义：每mg组织蛋白每分钟催化降解1nmol还原型细胞色素C定义为一个酶活力单位。

复合体Ⅳ活力(U/mg prot)=[ΔA×V反总÷（ε×d）×109]÷(V样×Cpr) ÷T

V反总：反应体系总体积；

ε：细胞色素C摩尔消光系数，1.91×104 L/mol/cm；

d：比色皿光径，1cm；

V样：加入样本体积；

T：反应时间，1min；

Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL，需自行测定；

10⁹：单位换算系数，1mol=10⁹nmol。

注意事项：

1、为保证实验结果的准确性，需先取1-2个样做预实验，如果测定的吸光值过高（高于1），可用蒸馏水稀释上清液后再测定。计算结果时注意乘以稀释倍数。若ΔA大于0.4，需将样本稀释适当倍数（计算公式中乘以相应稀释倍数），使A1-A2小于0.2，可提高检测灵敏度；若ΔA偏小，则可以通过增加加入的样本体积来提高灵敏度。

2、由于提取液中含有一定浓度的蛋白（约1mg/mL），所以在测定样本蛋白浓度时需要减去提取液本身的蛋白含量（单独测量）。

3、本试剂盒试剂足够完成50管反应。

4、附：使用样本重量计算公式：（检测样本数为50T/24S）

A、上清中复合体Ⅳ活力的计算：

单位定义：每g组织在反应体系中每分钟催化降解1nmol还原型细胞色素C定义为一个酶活力单位。

复合体Ⅳ活力(U/g 质量)=[ΔA上清×V反总÷（ε×d）×109]÷(W÷V提取×V样)÷T

ΔA上清：上清测定值；

V反总：反应体系总体积；

ε：细胞色素C摩尔消光系数，1.91×10⁴L/mol/cm；

d：比色皿光径，1cm；

V样：加入样本体积；

V提取：加入提取液体积；