服务热线
021-60498804
| Cat. Number | HK21534-96S |
||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Chemical Name | HK21534-96S 线粒体呼吸链复合体Ⅲ活性测试盒(酶标板法) |
||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Qty 1 |
100T/96S |
||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| References | 线粒体复合体Ⅲ（EC 1.10.2.2）又称CoQ-细胞色素C还原酶，广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞的线粒体中，是线粒体呼吸电子传递链主路和支路的共有成分，负责把还原型CoQ的氢传递给细胞色素C，生成还原型细胞色素C。
与氧化型细胞色素C不同，还原型细胞色素C在550nm有特征光吸收，因此550nm光吸收增加速率能够反映线粒体复合体Ⅲ酶活性。 实验中所需仪器和用品： 可见分光光度计/酶标仪、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、微量玻璃比色皿/96孔板（非聚苯乙烯材质）、研钵/匀浆器、冰和蒸馏水。 产品组成：
实验步骤： 注意：实验之前建议选择2-3 个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。 一、样本处理（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献） 1、称取约0.1g组织或收集500万细胞，加入1.0 mL提取液，用冰浴匀浆器或研钵匀浆。 2、4 ℃ 600 g离心10min。将上清液移至另一离心管中，4 ℃ 11000 g离心15min。 3、上清液即胞浆提取物，可用于测定从线粒体泄漏的复合体Ⅲ（此步可选做，可以判断线粒体提取效果）。 4、在沉淀中加入200μL提取液，超声波破碎（功率20%，超声5秒，间隔10秒，重复15次），用于复合体Ⅲ酶活性测定，并且用于蛋白含量测定。 二、试剂准备 工作液的配制：临用前把试剂R2转移到试剂R1中混合溶解，用不完的试剂4℃可保存一周； 三、测定步骤 1、可见分光光度计或酶标仪预热30min 以上，调节波长至550nm，蒸馏水调零。 2、操作表：在微量玻璃比色皿或96孔板中分别加入
四、复合体Ⅲ活力单位的计算 1、按微量玻璃比色皿计算： 按样本蛋白浓度计算 单位的定义：每mg组织蛋白每分钟催化产生1nmol还原型细胞色素C定义为一个酶活力单位。 复合体Ⅲ活力(U/mg prot)=[ΔA×V反总÷（ε×d）×109]÷(Cpr×V样) ÷T V反总：反应体系总体积，2×10-4L； ε：细胞色素C摩尔消光系数，1.91×104L/mol/cm； d：比色皿光径，1cm； V样：加入样本体积； T：反应时间，2min； Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL； 109：单位换算系数，1mol=109nmol。 2、按96孔板计算： 将上述公式中的d-1cm 改为d-0.6cm 进行计算即可。 注意事项： 1、尽量保持比色皿内反应液温度在37℃或25℃。可以在记录初始吸光度A1 后迅速将比色皿连同反应液一起放 入37℃（哺乳动物）或25℃（其它物种）水浴中准确反应2 分钟，之后迅速取出比色皿并擦干，记录2min时的吸光度。 2、当测定吸光值大于1 时，建议将样本用提取液稀释后测定，计算公式中注意乘以稀释倍数。 3、此法需要自行测定样本蛋白质浓度。 4、由于提取液中含有一定浓度的蛋白（约1mg/mL），所以在测定样本蛋白浓度时需要减去提取液本身的蛋白含量(单独测定)。 5、推荐使用样本蛋白浓度计算酶活，若用样本质量计算，则需加测胞浆提取物酶活，上清和沉淀酶活之和方为总酶活。 6、本试剂盒试剂足够完成100 管反应。 7、附:使用样本重量计算公式：（样本检测数为100T/24S） A、上清中复合体Ⅲ活力的计算: 单位的定义：每g组织每分钟催化产生1nmol还原型细胞色素C定义为一个酶活力单位。 复合体Ⅲ活力(U/g 质量)=[ΔA1×V反总÷（ε×d）×109]÷(W÷V提取×V样)÷T ΔA1：上清测定值； V反总：反应体系总体积； ε：细胞色素C摩尔消光系数，1.91×104L/mol/cm； d：比色皿光径，1cm； V样：加入样本体积； V提取：加入提取液体积； W：样本质量，g； T：反应时间，2min； 109：单位换算系数，1mol=109nmol。 B、沉淀中复合体Ⅲ活力的计算: 单位的定义：每g组织每分钟催化产生1nmol还原型细胞色素C定义为一个酶活力单位。 复合体Ⅲ活力(U/g 质量)=[ΔA2×V反总÷（ε×d）×109]÷(W÷V提取×V样)÷T ΔA2：沉淀测定值； V反总：反应体系总体积； ε：细胞色素C摩尔消光系数，1.91×104L/mol /cm； d：比色皿光径，1cm； V样：加入样本体积； V提取：加入提取液体积； W：样本质量，g； T：反应时间，2min； 109：单位换算系数，1mol=109nmol。 C、样本复合体Ⅲ总活力的计算: 样本复合体Ⅲ总活力即为上清中复合体Ⅲ活力与沉淀中复合体Ⅲ活力之和。 复合体Ⅲ（U/g 质量）=262×ΔA1÷W +52×ΔA2÷W D、以96孔板计算： 将上述公式中的d-1cm改为d-0.6cm进行计算即可。 本试剂盒仅供科研使用! |
||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Copyright © 2022 上海惠诚生物科技有限公司
沪ICP备2021037845号-6
