服务热线
021-60498804
| Cat. Number | HK21532-96S |
||||||||||||||||||||||||||||||
| Chemical Name | HK21532-96S 线粒体呼吸链复合体Ⅱ活性测试盒(酶标板法) |
||||||||||||||||||||||||||||||
| Qty 1 |
100T/96S |
||||||||||||||||||||||||||||||
| References | 线粒体复合体Ⅱ又称琥珀酸-辅酶Q还原酶，广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞的线粒体中，催化琥珀酸氧化生成延胡索酸，同时辅基 FAD还原为FADH2，后者进一步还原氧化型辅酶Q生成还原型辅酶Q，是呼吸电子传递链的支路。 检测原理： 复合体Ⅱ的催化产物还原型辅酶Q可进一步还原 2,6-二氯吲哚酚，2,6-二氯吲哚酚在 605nm 有特征吸收峰，通过检测 2,6-二氯吲哚酚的少速率来计算该酶活性。 需自备的仪器和用品： 可见分光光度计/酶标仪、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、微量玻璃比色皿/96孔板、丙酮、研钵/匀浆器、冰和蒸馏水。 产品组成：
实验步骤： 注意：实验之前建议选择2-3 个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。 一、样本处理（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献） 1、称取约0.1g组织或收集500万细胞，加入1.0 mL提取液，用匀浆器或研钵于冰上匀浆。 2、4 ℃ 600g离心10min。将上清液移至另一离心管中，4 ℃ 11000g离心15min。 3、上清液即胞浆提取物，可用于测定从线粒体泄漏的复合体Ⅱ（此步可选做，可以判断线粒体提取效果）。 4、在沉淀中加入400μL提取液，超声波破碎（功率20%，超声5秒，间隔10秒，重复15次），用于复合体Ⅱ酶活性 测定，并且用于蛋白含量测定。 二、试剂准备 1、试剂R2：溶于1 mL 丙酮，可分装后-20℃保存。临用前再用丙酮100 倍稀释后使用。 2、试剂R3：临用前加入2mL 丙酮溶解备用。 3、工作液的配制：临用前将试剂R2和试剂R3按1：1 混合，现用现配。 三、测定步骤 1、可见分光光度计/酶标仪预热30min 以上，调节波长至605nm，蒸馏水调零。 2、将试剂R1 37℃（哺乳动物）或25℃（其他物种）预热15min。 3、在微量玻璃比色皿/96孔板中分别加入：
四、复合体Ⅱ活力单位的计算 1. 按微量玻璃比色皿计算： 按样本蛋白浓度计算 单位的定义：每mg组织蛋白每分钟消耗1nmol 2,6-二氯吲哚酚定义为一个酶活力单位。 复合体Ⅱ活力(U/mg prot)= [ΔA×V反总÷（ε×d）×109]÷(V样×Cpr) ÷T V反总：反应体系总体积； ε：2,6-二氯吲哚酚摩尔消光系数，2.1×104L/mol/cm； d：比色皿光径，1cm； V样：加入样本体积； T：反应时间，2min； Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL； 109：单位换算系数，1mol=109nmol。 2. 以96孔板计算： 将上述公式中的d-1cm改为d-0.6cm进行计算即可。 注意事项： 1、为保证实验结果的准确性，需先取1-2个样做预实验，如果测定的吸光值过高（高于1.5），可用蒸馏水稀释上清液后再测定。计算结果时注意乘以稀释倍数。若ΔA大于0.4，需将样本稀释适当倍数（计算公式中乘以相应稀释倍数）；若ΔA偏小，则可以通过增加加入的样本体积来提高灵敏度。 2、样本蛋白浓度需自行测定。由于提取液中含有一定浓度的蛋白（约1mg/mL），所以在测定样本蛋白浓度时需要减去提取液本身的蛋白含量。 3、推荐使用样本蛋白浓度计算酶活，若用样本质量计算，则需加测胞浆提取物酶活，上清和沉淀酶活之和方为总酶活。 4、本试剂盒试剂足够完成100管反应。 5、附:使用样本重量计算公式：（样本检测数为100T/48S） A、上清中复合体II活力的计算: 单位的定义：每g组织在反应体系中每分钟消耗1nmol 2,6-二氯吲哚酚定义为一个酶活力单位。 复合体II活性（U/g 质量）= [ΔA1×V反总÷（ε×d）×109]÷(W÷V提取×V样本)）÷T ΔA1：上清测定值； V反总：反应体系总体积； ε：2,6-二氯吲哚酚摩尔消光系数，2.1×104L/mol/cm； d：比色皿光径，1cm； V提取：加入提取液体积； V样：加入样本体积； T：反应时间，2min； W：样本重量，g； 109：单位换算系数，1mol=109nmol。 B、沉淀中复合体II活力的计算: 单位的定义：每g组织在反应体系中每分钟消耗1nmol 2,6-二氯吲哚酚定义为一个酶活力单位。 复合体II活性（U/g 质量）= [ΔA2×V反总÷（ε×d）×109]÷(W÷V提取×V样本)）÷T ΔA2：沉淀测定值； V反总：反应体系总体积； ε：2,6-二氯吲哚酚摩尔消光系数，2.1×104L/mol/cm； d：比色皿光径，1cm； V提取：沉淀重悬体积； V样：加入样本体积； T：反应时间，2min； W：样本重量，g； 109：单位换算系数，1mol=109nmol。 C、样本复合体II总活力的计算: 样本复合体II总活力即为上清中复合体II活力与沉淀中复合体II活力之和。 复合体II（U/g 质量）=476.2×ΔA1÷W +190.5×ΔA2÷W D、以96孔板计算： 将上述公式中的d-1cm改为d-0.6cm进行计算即可。 本试剂盒仅供科研使用! |
||||||||||||||||||||||||||||||
Copyright © 2022 上海惠诚生物科技有限公司
沪ICP备2021037845号-6
