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| Cat. Number | HK21528-96S |
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| Chemical Name | HK21528-96S 线粒体呼吸链复合体Ⅰ活性测试盒(酶标板法) |
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| Qty 1 |
100T/96S |
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| References | 复合体Ⅰ（EC 1.6.5. 3）又称NADH-CoQ 还原酶或NADH脱氢酶，广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞的线粒体中，是线粒体内膜中最大的蛋白复合物。该酶催化一对电子从NADH传递给CoQ，同时可使O2还原生成O2-，是呼吸电子传递链上产生O2-的主要部位。测定该酶活性，不仅可以反映呼吸电子传递链（ETC）状态，而且可以反映活性氧（ROS）生成状态。 测定原理： 复合体Ⅰ能够催化NADH脱氢生成NAD+，在340nm下测定NADH的氧化速率计算出该酶活性的大小。 需自备的仪器和用品： 紫外分光光度计/酶标仪、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、微量石英比色皿/ 96 孔板（UV 版）、研钵/匀浆器、丙酮、冰和蒸馏水。 产品组成：
实验步骤： 注意：实验之前建议选择2-3 个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。 一、样本处理（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献） 1. 称取约0.1g 组织或收集500 万细胞，加入1.0 mL 提取液，用匀浆器或研钵于冰上匀浆。 2. 4℃ 600 g 离心10min。将上清液移至另一离心管中，4 ℃ 11000 g 离心15min。 3. 上清液即胞浆提取物，可用于测定从线粒体泄漏的复合体Ⅰ（此步可选做，可以判断线粒体提取效果）。 4. 在沉淀中加入400μL 提取液，超声波破碎（功率20%，超声5 秒，间隔10 秒，重复15 次），用于复合体Ⅰ酶活性测定，并且用于蛋白含量测定。 二、试剂准备 1、试剂R2：临用前加入1mL 丙酮； 2、试剂R3：溶于1mL 丙酮，可分装后-20℃保存。临用前再用丙酮100 倍稀释后使用，现用现配； 3、试剂R4：临用前加入2mL 蒸馏水，现配现用； 4、工作液的配制：临用前将试剂R2和试剂R3 1:1 混合，现配现用。 三、测定步骤 1. 紫外分光光度计/酶标仪预热30min 以上，调节波长至340nm，蒸馏水调零。 2. 试剂R1 37℃（哺乳动物）或25℃（其他物种）预热15min。 3. 操作表： 在微量石英比色皿/96孔板（UV版）中分别加入：
四、复合体Ⅰ活力单位的计算 1. 以微量石英比色皿计算： 单位定义：每mg 组织蛋白每分钟消耗1 nmol 的NADH 定义为一个酶活力单位。 复合体Ⅰ活力（U/mg prot）=[ΔA×V 反总÷（ε×d）×109]÷(V 样×Cpr) ÷T V 反总：反应体系总体积； ε：NADH 摩尔消光系数，6.22×103 L/mol/cm； d：比色皿光径，1cm； V样：加入样本体积； T：反应时间，2min； Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL； 109：单位换算系数，1mol=109nmol。 2. 以96 孔板计算： 将上述公式中的d-1cm 改为d-0.6cm 进行计算即可。 注意事项： 1. 为保证实验结果的准确性，需先取1-2 个样做预实验，如果测定的吸光值过高（高于1.5），可用蒸馏水稀释上清液后再测定。计算结果时注意乘以稀释倍数。若ΔA 大于0.4，需将样本稀释适当倍数（计算公式中乘以相应稀释倍数）；若ΔA 偏小，则可以通过增加加入的样本体积来提高灵敏度。 2. 样本蛋白浓度需自行测定。由于提取液中含有一定浓度的蛋白（约1mg/mL），所以在测定样本蛋白浓度时需要减去提取液本身的蛋白含量。 3. 推荐使用样本蛋白浓度计算酶活，若用样本质量计算，则需加测胞浆提取物酶活，上清和沉淀酶活之和方为总酶活。 4. 本试剂盒试剂足够完成100 管反应。 5. 附：使用样本重量计算公式：（样本检测数为100T/48S） A、上清中复合体I 活力的计算： 单位的定义：每g 组织在反应体系中每分钟消耗1 nmol NADH 定义为一个酶活力单位。 复合体I 活性（U/g 质量）= [ΔA1×V 反总÷（ε×d）×109]÷(W÷V 提取×V 样)÷T ΔA1：上清测定值； V 反总：反应体系总体积，2×10-4L； ε：NADH 摩尔消光系数，6.22×103 L/mol/cm； d：比色皿光径，1cm； V 提取：加入提取液体积 ； V 样：加入样本体积； T：反应时间，2min； W：样本重量，g； 109：单位换算系数，1mol=109nmol。 B、沉淀中复合体I 活力的计算: 单位的定义：每g 组织在反应体系中每分钟消耗1nmol NADH 定义为一个酶活力单位。 复合体I 活性（U/g 质量）= [ΔA2×V 反总÷（ε×d）×109]÷(W÷V 提取×V 样)）÷T ΔA2：沉淀测定值； V 反总：反应体系总体积，2×10-4L； ε：NADH 摩尔消光系数，6.22×103L/mol/cm； d：比色皿光径，1cm； V 提取：沉淀重悬体积； V 样：加入样本体积； T：反应时间，2min； W：样本重量，g； 109：单位换算系数，1mol=109nmol。 C、样本复合体I 总活力的计算： 样本复合体I 总活力即为上清中复合体I 活力与沉淀中复合体I 活力之和。 按样本质量计算：复合体I（U/g 质量）=1608×ΔA1÷W +643×ΔA2÷W D、以96 孔板计算： 将上述公式中的d-1cm 改为d-0.6cm 进行计算即可。 本试剂盒仅供科研使用! |
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