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| Cat. Number | HK21520-48S |
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| Chemical Name | HK21520-48S 细胞色素b5含量测试盒(可见分光光度法) |
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| Qty 1 |
50T/48S |
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| References | 细胞色素P450酶是一组主要存在于肝脏的同工酶，在外源物质代谢中具有重要作用，尤其是药物和毒物的代谢。细胞色素P450和细胞色素b5是P450酶系的两个血红素蛋白，其比值的变化与P450代谢活性密切相关。 测定原理： 氧化型细胞色素b5经连二亚硫酸钠还原后，在424nm处有最大吸收峰，通过测定424nm和490nm处吸光值的差异，即可计算出细胞色素b5的含量。 需自备的仪器和用品： 可见分光光度计、低温离心机、超速离心机、恒温培养箱、研钵/匀浆器、可调式移液器、1mL玻璃比色皿、冰和蒸馏水。 产品组成：
实验步骤： 注意：实验之前建议选择2-3 个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。 一、样本提取（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献） 1、除去细胞核和线粒体等：称约0.5g 组织，加入4℃预冷的1mL 试剂R1，冰上充分研磨，10000g，4℃离心30min，取上清液，转移到超速离心管中。 2、粗制微粒体：4℃，100000g，离心60min，弃上清液。 3、除血红蛋白等杂质：向步骤2 的沉淀中加1mL 试剂R1，盖紧后充分震荡溶解，100000g 离心30min，弃上清液。 4、最终微粒体：向步骤3 的沉淀中加0.5mL 试剂R2，盖紧后充分震荡溶解，即待测液，置于冰上待测。 二、试剂准备 1、试剂R1：临用前取一瓶加入50mL 蒸馏水，充分溶解；用不完的试剂4℃可保存4 周； 2、工作液配制：临用前取一瓶试剂R3，戴一次性手套，小心打开试剂R3瓶盖，缓慢加入30mL 试剂R2，充分溶解，4℃避光可保存1 周。 三、测定步骤 1、可见分光光度计预热30min 以上，调节波长至424nm 和490nm，蒸馏水调零。 2、空白管：取1mL玻璃比色皿，依次加入50μL 蒸馏水、1000μL 工作液，室温静置2min，分别测定424nm和490nm 处吸光值，424nm处吸光值记为A 空白管1，490nm 处吸光值记为A 空白管2。计算ΔA 空白管=A 空白管1-A 空白管2。注：空白管只需做1-2 次。 3、测定管：取1mL玻璃比色皿，依次加入50μL 待测液、1000μL 工作液，室温静置2min，分别测定424nm和490nm 处吸光值，424nm 处吸光值记为A 测定管1，490nm 处吸光值记为A 测定管2。计算ΔA 测定管=A 测定管1-A 测定管2。 四、细胞色素b5含量计算 a.使用微量石英比色皿测定的计算公式如下 （1）按蛋白浓度计算 细胞色素b5 含量(nmol/mg prot) = (ΔA 测定管-ΔA 空白管)÷(ε×d)×V 反总÷（Cpr×V 样） （2）按样本质量计算 细胞色素b5 含量（nmol/g 质量）= (ΔA 测定管-ΔA 空白管)÷(ε×d)×V 反总×（V 样总÷V 样）÷W ε：还原型细胞色素b5 纳摩尔消光系数，171×10-6 L/nmol/cm； d：比色皿光径（cm），1cm； V 反总：反应体系总体积； Cpr：待测液蛋白质浓度（mg/mL），需要另外测定； V 样：加入反应体系中待测液体积； V 样总：待测液总体积； W：样品质量，g。 b.使用96 孔板测定的计算公式如下 将上述计算公式中比色皿光径d=1cm 改为d=0.5cm。 注意事项： 1、如果测定吸光值A＞1.2 或ΔA＞0.8，建议稀释样本后再测定，计算公式中乘以稀释倍数。 2、如果测定吸光值较低或接近空白OD 值，建议增加样本量后再进行测定，注意同步修改计算公式。 本试剂盒仅供科研使用! |
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