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| Cat. Number | HK21518-24S |
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| Chemical Name | HK21518-24S 细胞壁不溶性酸性转化酶(CWI)测试盒(可见分光光度法) |
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| Qty 1 |
50管/24S |
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| References | 蔗糖转化酶（Invertase，Inv）不可逆的催化蔗糖裂解形成葡萄糖和果糖，在植物蔗糖代谢中发挥着重要作用。Inv根据最适pH，可分为酸性转化酶（AI）和中性转化酶（NI），其中AI 根据亚细胞定位的差异又可分为可溶性酸性转化酶（Soluble acid Invertase，SAI）和细胞壁结合酸性转化酶（Cell wall-bound acid Invertase，CWI）。 CWI以离子键的形式结合在细胞壁上，在“库”组织韧皮部蔗糖卸载、蔗糖质外运输、植物的生长发育以及抵抗各种胁 迫中起着重要作用。 测定原理： 细胞壁结合酸性转化酶CWI 催化蔗糖降解产生还原糖，还原糖与3,5 –二硝基水杨酸反应生成在540nm 有特征吸收峰的棕红色物质，通过测定540nm 处吸光值变化可计算得CWI 活性。 需要的仪器，耗材: 1、可见分光光度计 2、台式离心机 3、可调式移液器 4、微量石英比色皿/96孔板 5、研钵、冰和蒸馏水。 产品组成：
实验步骤： 注意：实验之前建议选择 2-3 个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者 增加样本量进行检测。 一、样本处理（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献） 组织：按照质量（g）：提取液一体积（mL）为1：5~10 的比例（建议称取约0.1g，加入1mL 提取液一）加入提取液，冰浴匀浆后于4℃，12000g，离心10min，弃上清，留沉淀；沉淀中加入1mL 蒸馏水，充分震荡混匀，4℃，12000g 离心10min，弃上清，留沉淀；沉淀中加入1mL 提取液二，充分混匀，4℃浸提15h，4℃，12000g，离心10min，取上清置于冰上待测。 二、试剂准备 1、试剂R2：临用前加入试剂R1充分溶解备用； 2、标准品：10mg 葡萄糖，临用前加入 1mL 蒸馏水溶解，制备 10mg/mL 葡萄糖标准液备用，2-8℃保存一周。 三、测定步骤 1、分光光度计预热30min 以上，调节波长至540nm，蒸馏水调零。 2、标准品的制备：将标准液用蒸馏水稀释成2、1、0.8、0.6、0.5、0.4、0.3mg/mL 葡萄糖标准液。 3、操作表：（在1.5mLEP管中依次加入下列试剂）
注意：如果样本在37℃反应后的95℃水浴步骤中出现沉淀，建议室温12000g，离心5min，取上清（若上清不足1000μL，可按比例缩小加样体系，如800μL 上清+400μL 试剂三）进行下一步操作。 四、CWI活性计算 1、标准曲线的绘制： 以各个标准溶液的浓度为x 轴，其对应的ΔA 标准为y 轴，绘制标准曲线，得到标准方程y=kx+b，将ΔA 带入方程得到x（mg/mL）。 2、CWI 活性的计算： （1）按蛋白浓度计算 酶活定义：37℃每mg 蛋白每分钟分解蔗糖产生1μg 还原糖为1 个酶活力单位。 CWI 酶活（U/mg prot）= x×V 提取÷（V 提取×Cpr）×103÷T （2）按样本质量计算 酶活定义：37℃每g 样本每分钟分解蔗糖产生1μg 还原糖为1 个酶活力单位。 CWI 酶活（U/g 质量）= x×V 提取×103÷W÷T V 提取：提取液二体积； 103：单位换算系数； Cpr：样本蛋白浓度，mg/mL，蛋白浓度自行测定； W：样本质量，g； T：反应时间，30min。 注意事项： 1. 当A 或ΔA 超过1.5 时，建议将样本用提取液二稀释后再进行测定，计算公式中乘以稀释倍数。 2. 95℃水浴时EP 管盖紧，防止水分散失，待冷却至室温后（建议每次实验后冷却时间保持一致），再进行下一步操作，避免液体飞溅烫伤以及影响试验数据。 本试剂盒仅供科研使用! |
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