辅酶I包括还原型和氧化型两种形式，在生物氧化中起传递氢的作用。氧化型辅酶I 又称烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD+）是脱氢酶的辅酶，它在糖酵解、糖异生、三羧酸循环和呼吸链中发挥着不可替代的作用。中间产物会将脱下的氢递给NAD，使之成为NADH（还原型辅酶I）。而NADH 则会作为氢的载体，在呼吸链中通过化学渗透偶联的方式，合成 ATP。NAD(H)在机体内有重要的生理意义，与物质代谢、能量代谢、抗细胞衰老、抗氧化以及一些疾病的发生密切相关。体内辅酶I 含量降低会导致细胞损伤或衰亡。

测定原理：

分别用酸性和碱性提取液提取样本中NAD+和NADH，在1-mPMS 作用下，WST-1 可与NADH 反应，产生水溶性formazan，在450nm 下有特征吸收峰，而NAD+可被乙醇脱氢酶还原为NADH，进一步采用WST-1检测。

需自备的仪器和用品：

可见分光光度计/酶标仪、低温离心机、水浴锅，研钵/匀浆器、超声破碎仪、可调式移液器、微量玻璃比色皿/96孔板、冰和蒸馏水。

产品组成：

实验步骤：

注意：实验之前建议选择2-3 个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。

一、样本处理（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献）

1、血清（浆）中NAD+和NADH 的提取：

NAD+的提取：建议取0.1mL 血清（血浆），加入0.5mL 酸性提取液，煮沸5min(盖紧，以防止水分散失)；冰浴冷却后，10000g， 4℃离心10min；取200μL 上清液，加入200μL 碱性提取液使之中和；混匀，10000g 4℃离心 10min，取上清，冰上待测。

NADH 的提取：建议取0.1mL 血清（血浆），加入0.5 mL 碱性提取液，煮沸5min (盖紧，以防止水分散失)；冰浴冷却后，10000g， 4℃离心10min；取200μL 上清液，加入200μL 酸性提取液使之中和；混匀，10000g 4℃离心 10min，取上清，冰上待测。

2、组织中NAD+和NADH 的提取：

NAD+的提取：建议取0.1g 组织质量，加入0.5mL 酸性提取液，冰浴研磨，煮沸5min (盖紧，以防止水分散失)；冰浴冷却后，10000g， 4℃离心10min；取200μL 上清液，加入200μL 碱性提取液使之中和；混匀，10000g 4℃离心 10min，取上清，冰上待测。

NADH 的提取：建议取0.1 g 组织质量，加入0.5 mL 碱性提取液，冰浴研磨，煮沸5min (盖紧，以防止水分散失)；冰浴冷却后，10000g， 4℃离心10min；取200μL 上清液，加入200μL 酸性提取液使之中和；混匀，10000g 4℃离心 10min，取上清，冰上待测。

3、细胞或细菌中 NAD 和 NADH 的提取：

NAD+的提取：先收集细胞或细菌到离心管内，离心弃上清，建议500 万细胞或者细菌加入0.5mL 酸性提取液，超声波破碎（冰浴，功率200W，超声3s，停10s，重复30 次），煮沸5min(盖紧，以防止水分散失)；冰浴冷却后，10000g， 4℃离心10min；取200μL 上清液，加入200μL 碱性提取液使之中和；混匀，10000g 4℃离心 10min，取上清，冰上待测。

NADH 的提取：建议500 万细胞或者细菌加入0.5mL 碱性提取液，超声波破碎（冰浴，功率200W，超声3s，停10s，重复30 次），煮沸 5min(盖紧，以防止水分散失)，；冰浴冷却后，10000g， 4℃离心10min；取200μL 上清液，加入200μL 酸性提取液使之中和；混匀，10000g 4℃离心 10min，取上清，冰上待测。

二、试剂准备

1、NAD 标准品：临用前加入 1.5 mL 蒸馏水，即 2 μmol/mL。-20℃可以保存2 周。

2、NADH 标准品：临用前加入 1.4 mL 蒸馏水，即 2 μmol/mL。-20℃可以保存2 周。

三、测定步骤

1、分光光度计/酶标仪预热30 min 以上，调节波长至450 nm，分光光度计蒸馏水调零。

2、NAD+标准品：用蒸馏水稀释为1.25、0.625、0.3125、0.15625、0.078、0.039、0.0195、0nmol/mL 的标准溶液，0nmol/mL 即空白管。

3、NADH 标准品：用蒸馏水稀释为10、5、2.5、1.25、0.625、0.3125、0.15625、0.078、0nmol/mL 的标准溶液，0nmol/mL即空白管。

4、稀释表（附于说明书最后）

5、在EP 管中按顺序加入下列试剂：

混匀， 450nm 下比色，读取吸光值，NAD+的记为：ΔANAD=A2- A1，NADH 的记为ΔANADH= A2'- A1'，NAD标准管的记为ΔA NAD 标= A 标-A 空白管。NADH 标准管的记为ΔA NADH 标=A 标'-A 空白管。（标准曲线只需做1-2次，每个测定管需设一个对照管）

四、NAD+和NADH 含量计算

1、标准曲线绘制：

（1） NAD+标准曲线的绘制：

根据标准管的浓度（x1，nmol/mL）和吸光度ΔA标准（y1，ΔA标准），建立标准曲线。根据标准曲线，将ΔA测定代入方程得到x1（nmol/mL）。

（2） NADH标准曲线的绘制

根据标准管的浓度（x2，nmol/mL）和吸光度ΔA标准（y2，ΔA标准），建立标准曲线。根据标准曲线，将ΔA´代入方程得到x2（nmol/mL）。

2、NAD+和NADH含量计算

（一）NAD+含量计算

（1） 按液体体积计算：

NAD+含量(nmol/mL）= x1×（V 提取+V 血清）÷V 血清

（2） 按样本蛋白浓度计算 

NAD+ (nmol/mg prot）= x1×V 提取÷(V 提取×Cpr)

（3） 按样本鲜重计算

NAD+含量(nmol/g 质量）= x1×V 提取÷W

（4） 按细胞数量计算

NAD+含量(nmol/10⁴ cell）= x1×V 提取÷500

（二）NADH 含量计算

（1） 按液体体积计算：

NADH 含量(nmol/mL）= x2×（V 提取+V 血清）÷V 血清

（2） 按样本蛋白浓度计算 

NADH (nmol/mg prot）= x2×V 提取÷(V 提取×Cpr)

（3） 按样本鲜重计算

NADH 含量(nmol/g 质量）= x2×V 提取÷W

（4） 按细胞数量计算

NADH 含量(nmol/10⁴ cell）= x2×V 提取÷500

V提取：加入提取液体积；

V血清：血清（浆）体积；

Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；

W：样本质量，g；

500：细菌或细胞总数，500万。

注意事项：

1、反应过程中注意避光。

2、如果测定吸光值超过线性范围吸光值，可以增加样本量或者稀释样本后再进行测定。

本试剂盒仅供科研使用!

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