HK21421-24S 糖原磷酸化酶b(GPb)测试盒(紫外分光光度法)_上海惠诚生物生物试剂,标准品,仪器设备,耗材,一站式服务

糖原的分解主要在糖原磷酸化酶a的催化下进行。未添加激活剂时，糖原磷酸化酶a催化糖原和无机磷产生葡萄糖残基生成糖原和1-磷酸葡萄糖，磷酸葡萄糖变位酶和6-磷酸葡萄糖脱氢酶进一步依次催化NADP还原生成NADPH，在340nm下测定NADPH上升速率，即可反映糖原磷酸化酶a活性。添加激活剂测定GP（GPa和GPb）总活性，未添加激活剂时测定GPa活性，GP活性-GPa活性得到GPb活性。

需自备的仪器和用品:

紫外分光光度计、低温离心机、恒温培养箱/水浴锅、研钵/匀浆器、电子天平、可调式移液器、1mL石英比色皿、冰和蒸馏水。

产品组成：

试剂名称	规格	保存条件
提取液	液体×1瓶	2-8℃
试剂R1	液体×1瓶	2-8℃
试剂R2	粉剂×1支	2-8℃
试剂R3	粉剂×1支	2-8℃
试剂R4	粉剂×1支	2-8℃
试剂R5	粉剂×3支	2-8℃
试剂R6	粉剂×3支	2-8℃
试剂R7	粉剂×1瓶	2-8℃

实验步骤:

注意:实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。

一、样本处理（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献)

1、组织：按照组织质量(g)︰提取液体积(mL)为1∶5~10的比例(建议称取约0.1 g组织，加入1 mL提取液）进行冰浴匀浆，然后8000 g，4℃，离心10 min，取上清置于冰上待测。

2、血清（浆)：直接检测。若有浑浊可以离心后取上清进行测定。

3、细菌或者细胞：先收集细胞或细菌样本到离心管内，弃上清，按照每500万细胞或细菌加入1mL提取液，超声波破碎细菌或细胞（功率200W，超声3s，间隔10s，重复30次)。8000g，4C离心10min，取上清，置冰上待测。

二、试剂准备

1、试剂R2：临用前加入1.25 mL 蒸馏水，充分混匀；2-8℃保存2 个月；

2、试剂R3：临用前加入1.25 mL 蒸馏水，充分混匀；可分装后-20℃保存4 周，避免反复冻融；

3、试剂R4：临用前加入1.25mL 蒸馏水，充分混匀；可分装后-20℃保存4 周，避免反复冻融；

4、试剂R5：临用前每支加入1 mL 蒸馏水，充分混匀；可分装后-20℃保存4 周，避免反复冻融；

5、试剂R6：临用前每支加入1 mL 蒸馏水，充分混匀；可分装后-20℃保存4 周，避免反复冻融；

6、试剂R7：临用前加入4 mL 蒸馏水，充分混匀后-20 分装保存4 周，避免反复冻融；

7、工作液的配制：临用前根据实验所需用量，按照试剂R1：试剂R2：试剂R3：试剂R4 =740μL: 20μL:20μL: 20μL（1T 的量）的比例，充分混匀，现用现配。

三、测定步骤

l、紫外分光光度计预热30 min以上，调节波长至340 nm，蒸馏水调零。

2、工作液置于37℃预热5min。

3、GPa活性：在1mL石英比色皿中依次加入

试剂名称(uL)	GPa活性检测
样本	50
试剂R5	50
试剂R6	50
蒸馏水	50
工作液	800
充分混匀10s，记录340nm处10s时吸光值A1，37℃水浴锅或者恒温培养箱反应10min(酶标仪有控温功能的可以调节温度至37C)，反应后拿出迅速擦干测定10min10s时吸光值A2。计算ΔAcPa=A2-A1。

4、GP活性：在1mL石英比色皿中依次加入

试剂名称(uL)	GP活性检测
样本	50
试剂R5	50
试剂R6	50
试剂R7	50
工作液	800
充分混匀10s，记录340nm处10s时吸光值A1，37℃水浴锅或者恒温培养箱反应10min(酶标仪有控温功能的可以调节温度至37C)，反应后拿出迅速擦干测定10min10s时吸光值A2。计算ΔAcPa=A2-A1。

四、糖原磷酸化酶b(GPb)活性计算

(1）按样本蛋白浓度计算

单位定义：每 mg组织蛋白每分钟产生1nmol NADPH定义为一个酶活力单位。

GPb(U/mg prot)）=(ΔAcp-ΔAcPa)×V反总÷(εxd)×10⁹]÷(V样×Cpr)÷T

(2）按样本鲜重计算

单位定义：每g组织每分钟产生1nmol NADPH定义为一个酶活力单位。

GPb (U/g质量）=[(ΔAcp-ΔAca)×V反总÷(ε×d)×10⁹]÷(W×V样÷V样总)÷T

(3）按样本体积计算

单位定义：每mL液体每分钟产生1nmol NADPH定义为一个酶活力单位

GPa (U/mL)=[(ΔAcp-ΔAGPa)×V反总÷(εxd)×10⁹]÷V样÷T

(4）按细胞数量计算

单位定义：每1万个细胞每分钟产生lnmol NADPH定义为一个酶活力单位。