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Cat. Number

HK21420-96S

Chemical Name

HK21420-96S 糖原磷酸化酶a(GPa)测试盒(酶标板法)

Qty 1

100T/96S

References

糖原磷酸化酶是糖原分解代谢中的关键酶，催化糖原的磷酸化反应。该酶分为有活性的糖原磷酸化酶a(Glycogen phosphorylase a, GPa）和无活性的糖原磷酸化酶b(Glycogen phosphorylase b, GPb）两种形式。糖原的分解主要在糖原磷酸化酶 a的催化下进行。

测定原理：

未添加激活剂时，糖原磷酸化酶 a催化糖原和无机磷产生葡萄糖残基生成糖原和1-磷酸葡萄糖，磷酸葡萄糖变位酶和6-磷酸葡萄糖脱氢酶进一步依次催化NADP还原生成NADPH,在340nm下测定NADPH上升速率，即可反映糖原磷酸化酶a活性。

需自备的仪器和用品:

紫外分光光度计/酶标仪、低温离心机、恒温培养箱/水浴锅、研钵/匀浆器、可调式移液器、微量石英比色皿/96孔UV板、冰和蒸馏水。

产品组成：

试剂名称	规格	保存条件
提取液	液体×1瓶	2-8℃
试剂R1	液体×1瓶	2-8℃
试剂R2	粉剂×1支	2-8℃
试剂R3	粉剂×1支	2-8℃
试剂R4	粉剂×1支	-20℃
试剂R5	粉剂×2支	-20℃
试剂R6	粉剂×2支	-20℃

实验步骤：

注意:实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。

一、样本处理（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献）

l、组织：按照组织质量(g)︰提取液体积(mL)为1∶5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加入 1 mL提取液）进行冰浴匀浆，然后8000 g，4℃，离心10 min，取上清置于冰上待测。

2、细菌或者细胞：先收集细胞或细菌样本到离心管内，弃上清，按照每500万细胞或细菌加入lmL 提取液，超声波破碎细菌或细胞（功率200W，超声3s，间隔 10s，重复30次)。8000g，4C离心10min，取上清，置冰上待测。

3、血清（浆)：直接检测

二、试剂准备

1、试剂R2：临用前加入0.5 mL蒸馏水，充分混匀;

2、试剂R3：临用前加入0.5 mL蒸馏水，充分混匀;可分装后-20C保存4周，避免反复冻融;

3、试剂R4：临用前加入1.25 mL蒸馏水，充分混匀;可分装后-20℃保存4周，避免反复冻融;

4、试剂R5：临用前取一支加入1 mL蒸馏水，充分混匀；可分装后-20℃保存4周，避免反复冻融；1瓶粉剂即可做100T，为延长使用时间，故多给一支。

5、试剂R6：临用前取一支加入 1 mL蒸馏水，充分混匀；可分装后-20°C保存4周，避免反复冻融；1瓶粉剂即可做100T，为延长使用时间，故多给一支。

6、工作液的配制：临用前根据实验所需用量，按照试剂R1:试剂R2:试剂R3:试剂R4:蒸馏水=148L:4LuL:4uL:4uL: 10uL(1T的量）的比例，充分混匀，现用现配。

三、测定步骤

1、紫外分光光度计/酶标仪预热30 min以上，调节波长至340 nm，分光光度计蒸馏水调零。

2、临用前工作液置于37℃预热 5min。

3、在微量石英比色皿或96孔UV板中依次加入10 uL样本、10 uL试剂R5、10 uL试剂R6、170 uL工作液，充分混匀10s，记录 340nm处10s时吸光值A，37C水浴锅或者恒温培养箱反应10min （酶标仪有控温功能的可以调节温度至37℃)，反应后拿出迅速擦干测定10min10s时吸光值A2。计算△A=A2-A1。

四、糖原磷酸化酶a(GPa)活性计算

a.用微量石英比色皿测定的计算公式如下:

(1）按样本蛋白浓度计算

单位定义:每 mg组织蛋白每分钟产生1nmol NADPH定义为一个酶活力单位。

GPa (U/mg prot）=[△A×V反总÷(ε×d)×10⁹]÷(V样×Cpr)÷T

(2）按样本鲜重计算

单位定义:每g组织每分钟产生1nmol NADPH定义为一个酶活力单位。

GPa (U /g质量）=[△A×V反总÷(ε×d)×10⁹]÷(W×V样÷V样总)÷T

(3）按样本体积计算

单位定义:每mL液体每分钟产生1nmol NADPH定义为一个酶活力单位

GPa (U/mL）=[△A×V反总÷(ε×d)×10⁹]÷V样÷T

(4)按细胞数量计算