哺乳动物CarE，也称脂族酯酶（aliesterase），广泛分布于组织和器官，属于丝氨酸水解酶家族。CarE催化含酯键、酰胺键和硫酯键的内源性与外源性物质水解，但不能催化水解乙酰胆碱及其类似物。CarE参与脂质运输和代谢，并且与多种药物、环境毒物以及致癌物的解毒和代谢有关，有机磷农药可结合并且抑制CarE活性。

测定原理：

CarE能催化乙酸-1-萘酯生成萘酯，固蓝显色；在450 nm光吸收增加速率，计算CarE活性。

需自备的仪器和用品：

可见分光光度计/酶标仪、微量玻璃比色皿/96孔板、低温离心机、水浴锅、可调式移液枪、研钵/匀浆器、蒸馏水。

产品组成：

实验步骤:

注意：实验之前建议选择2-3 个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。

一、样本处理（具体比例可以参考文献）

细菌或培养细胞：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照每200万细菌或细胞加入400μL提取液，超声波破碎细胞（功率20%，超声3s，间隔10s，重复30次）；然后15000rpm，4℃，离心10min，取上清（若上清不够澄清，建议重复上述离心步骤），置于冰上待检。

组织：按照组织质量（g）: 提取液体积(mL)为1 : 5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1mL提取液），进行冰浴匀浆。15000rpm，4℃，离心10min，取上清（若上清不够澄清，建议重复上述离心步骤），置于冰上待检。

血清：直接测量。

二、试剂准备

1、试剂R1：临用前先加入1.25mL 无水乙醇，震荡使其大部分溶解，再加入8.75mL 试剂R3，震荡至充分溶解；

2、试剂R2：临用前取16 mL 试剂R3加入试剂R3瓶中震荡使其充分溶解，临用前配制。本试剂溶解后为淡黄色，且在常温下不稳定，建议根据样本量取适当配好的试剂R2置于冰上待用，剩余试剂分装后置于-20℃保存，禁止反复冻融。

三、测定步骤

1、分光光度计/酶标仪预热30min以上，调节波长至450nm，蒸馏水调零。

2、试剂R1置于37℃水浴中预热10 min以上，试剂R2在检测过程中需置于冰上待用。

3、在微量玻璃比色皿或96孔板中进行如下操作：

将上述试剂按照先后顺序分别加入微量比色皿或96 孔板中，加入试剂一即开始计时，迅速混匀后，测定第10s的吸光值记为A1 空和A1 测，37℃条件下准确反应5min，测定310s 的吸光值，记为A2 空、A2 测。计算ΔA 空白管=A2 空-A1 空，ΔA 测定管=A2 测-A1 测。（空白管只需做1~2 次）

（注意：本试剂盒反应时应保持37℃的环境，一般酶标仪有控温功能，可直接设置成37℃，待温度上升至37℃后即可开始试验；若用没有控温装置的分光光度计，则可以用恒温水浴锅辅助反应，具体操作如下：将上述试剂按照先后顺序分别加入比色皿中，加入试剂一即开始计时，迅速吹打混匀，记录第10s 的吸光值A1，迅速将比色皿连同反应液一起放入37℃水浴中准确反应5min，之后迅速取出比色皿并擦干，记录310s 时的吸光度A2，计算ΔA=A2-A1。）

四、CarE 活性计算

A、使用微量玻璃比色皿测定的计算公式

1. 按样本蛋白浓度计算：

单位的定义：37℃下，每mL反应体系每mg组织蛋白每分钟催化吸光值增加1定义为一个酶活力单位。

CarE酶活(U/mg prot)= (ΔA测定管-ΔA空白管) ×V反总÷1÷(Cpr×V样)÷T×F

2. 按样本质量计算：

单位的定义：37℃下，每mL反应体系每g组织每分钟催化吸光值增加1定义为一个酶活力单位。

CarE酶活(U/g 质量)= (ΔA测定管-ΔA空白管) ×V反总÷1÷(W÷V样总×V样)÷T×F

3. 按细菌或细胞数量计算：

单位的定义：37℃下，每mL反应体系每1万个细菌或细胞每分钟催化吸光值增加1定义为一个酶活力单位。

CarE酶活(U/104 cell)= (ΔA测定管-ΔA空白管) ×V反总÷1÷(200÷V细胞样总×V样)÷T×F

4. 按血清体积计算：

单位的定义：37℃下，每mL反应体系每mL血清每分钟催化吸光值增加1定义为一个酶活力单位。

CarE酶活(U/mL)= (ΔA测定管-ΔA空白管) ×V反总÷1÷V血清÷T

V样总：上清液总体积；

V样：加入样本体积；

T：反应时间，5min；

Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；

W：样本质量，g；

200：细菌或细胞总数，200万；

V细胞样总：细胞中加入的提取液体积；

V血清：加入血清体积；

V反总：反应体系总体积；

F：稀释倍数。

B、使用96孔板测定的计算公式

1. 按样本蛋白浓度计算：

单位的定义：37℃下，每mL反应体系每mg组织蛋白每分钟催化吸光值增加0.5定义为一个酶活力单位。

CarE酶活(U/mg prot)= (ΔA测定管-ΔA空白管) ×V反总÷0.5÷(Cpr×V样)÷T×F

2. 按样本质量计算：

单位的定义：37℃下，每mL反应体系每g组织质量每分钟催化吸光值增加0.5定义为一个酶活力单位。

CarE酶活(U/g 质量)= (ΔA测定管-ΔA空白管) ×V反总÷0.5÷(W ÷V样总×V样)÷T×F

3. 按细菌或细胞数量计算：

单位的定义：37℃下，每mL反应体系每1万个细菌或细胞每分钟催化吸光值增加0.5定义为一个酶活力单位。

CarE酶活(U/104 cell)= (ΔA测定管-ΔA空白管) ×V反总÷0.5÷(200÷V细胞样总×V样)÷T×F

4. 按血清体积计算：

单位的定义：37℃下，每mL反应体系每mL血清每分钟催化吸光值增加0.5定义为一个酶活力单位。

CarE酶活(U/mL)= (ΔA测定管-ΔA空白管) ×V反总÷0.5÷V血清÷T×F

V样总：上清液总体积；

V样：加入样本体积；

T：反应时间，5min；

Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；

W：样本质量，g；

200：细菌或细胞总数，200万；

V细胞样总：细胞中加入的提取液体积；

V血清：加入血清体积；

V反总：反应体系总体积；

F：稀释倍数。

注意事项：

1、试剂R2为-20℃储存试剂，在常温下不稳定，一般常温放置2-3 小时即可明显发现液体由浅黄色变为浅褐色（液体变褐色视为变质，不可用）。建议试验前根据样本量计算所需试剂R2的用量，在试剂R2溶解后，留取所需用量置于冰上待用，剩余试剂可分装后-20℃储存。

2、动物组织样本一般稀释8 倍或更大稀释倍数后进行操作测定。

3、当吸光值大于1 时，建议将样本稀释后测量。计算公式注意乘以稀释倍数。

4、为保证反应时间的准确性，建议逐一比色；如想用96 孔板对多样本同时检测，建议使用排枪，且一次最多8个或12 个孔（8 道排枪或12 道排枪）。

本试剂盒仅供科研使用!