HK21394-96S 山梨醇脱氢酶(SDH)测试盒(酶标板法)_上海惠诚生物生物试剂,标准品,仪器设备,耗材,一站式服务

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Cat. Number

HK21394-96S

Chemical Name

HK21394-96S 山梨醇脱氢酶(SDH)测试盒(酶标板法)

Qty 1

100T/96S

References

山梨醇脱氢酶SDH(EC 1.1.1.14）催化山梨醇脱氢生成果糖，是调控生物体内山梨醇含量的关健酶之一。

测定原理：

SDH催化山梨醇脱氢生成果糖，同时还原NAD+生成NADH，生成的NADH能将电子传递给NBT生成紫色的甲朦，测定340nm吸光度增加速率可以计算SDH活性。

需自备的仪器和用品:

可见分光光度计/酶标仪、台式离心机、水浴锅/恒温培养箱、超声破碎仪，可调式移液器、微量玻璃比色皿/96孔板、研钵/匀浆器、冰和蒸馏水。

产品组成：

试剂名称	规格	保存条件
提取液	液体×1 瓶	2-8℃
试剂R1	粉剂×5 瓶	2-8℃
试剂R2	液体×1 瓶	2-8℃
试剂R3	液体×1 瓶	2-8℃
试剂R4	粉剂×5 支	-20℃
试剂R5	液体×1 瓶	2-8℃
标准品	粉剂×1支	-20℃

实验步骤:

注意:实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。

一、样本处理（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献）

1、细菌或培养细胞：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照细菌或细胞数量（10个):提取液体积(mL)为500~1000: 1的比例(建议500万细菌或细胞加入1mL 提取液)，超声波破碎细菌或细胞（冰浴功率200W，超声3s，间隔10s，重复30次)；8000xg 4C离心10 min，取上清，置冰上待测。

2、组织：按照组织质量(g)：提取液体积(mL)为 1:5~10 的比例(建议称取约0.1 g组织，加入1mL提取液)，进行冰浴匀浆。8000 xg 4℃离心10 min，取上清，置冰上待测。

3、血清（浆）样本：直接检测。

二、试剂准备

1、试剂R1：取3.4 mL试剂R5加入1瓶试剂R1粉剂中溶解，再加入一支试剂R4，现用现配，24h变质;

2、标准品：临用前加入1.4 mI蒸馏水，即 10 umolmLNADH标准品。-20°C保存4周，避免反复冻融。

三、测定步骤

1、可见分光光度计/酶标仪预热30 min 以上，调节波长至570nm，可见分光光度计蒸馏水调零。

2、标准管的测定:将10 umol/mL NADH标准品用水稀释至1.5、1、0.9、0.8、0.7、0.6、0.5、0.4、0.3 umol/mL的标准溶液。

标准品测定表：

试剂名称	标准管	空白管
标准溶液	20	-
蒸馏水	-	20
试剂R2	30	30
试剂R3	30	30
试剂R1	120	120
混匀后室温避光放置20 min,取200 uL于微量玻璃比色皿/96孔板中分别测定标准管和空白管在570 nm下的吸光度，记为A标准管、A空白管，计算ΔA标准=A标准管-A空白管。标准曲线只需做1-2次。

3、样本的测定

试剂名称(uL)	测定管
样本	20
试剂R2	30
试剂R3	30
试剂R1	120

将上述试剂按顺序加微量玻璃比色皿/96孔板中，加样本的同时开始计时，记录10秒时的初始吸光度A1，比色后迅速将比色皿连同反应液一起放入37℃（哺乳动物)或25℃(其它物种)水浴中准确反应3分钟；迅速取出比色皿并擦干，570nm下比色，记录3分10秒时的吸光度A2，计算ΔA测定=A2-A1。(整个实验过程要避光)

四、SDH 活性计算

1、标准曲线的绘制:

根据标准管的浓度(x,umol/mL)和吸光度ΔA标准(y，ΔA标准)，建立标准曲线。根据标准曲线，将ΔA测定（y，ΔA测定）带入公式计算样本浓度(x，umol/mL) 。

2、SDH活性计算:

(1）血清（浆）SDH 活力的计算

单位的定义：每毫升血清（浆）每分钟生成1 nmo1 NADH定义为一个酶活力单位。

SDH (U/mL)=1000×x×V样÷V样÷T

(2）组织、细菌或细胞中 SDH 活力的计算1）按样本蛋白浓度计算

单位的定义：每mg组织蛋白每分钟生成1 nmolNADH定义为一个酶活力单位。

SDH (U/mg prot）=1000×x×V样÷(V样×Cpr)÷T

2）按样本质量计算

单位的定义：每g组织每分钟消耗1 nmol NADH定义为一个酶活力单位。