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| Cat. Number | HK21384-96S |
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| Chemical Name | HK21384-96S 羟脯氨酸(HYP)测试盒(酶标板法) |
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| Qty 1 |
100T/96S |
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| References | 羟脯氨酸HYP 是机体胶原蛋白主要成分之一，胶原蛋白大多分布于皮肤、腱、软骨和血管等，因此HYP含量是反映胶原组织代谢及纤维化程度的一项重要指标。 测定原理： 样本经水解产生游离的HYP，进一步被氯胺T氧化，氧化产物与对二甲氨基苯甲醛反应，产生红色化合物，在560nm处有特征吸收峰。通过测定样本水解液560nm吸光值，可计算HYP含量。 需自备的仪器和用品： 天平、玻璃管、离心机、水浴锅、可见分光光度计/酶标仪、微量玻璃比色皿/96 孔板、6mol/L 盐酸和蒸馏水。 产品组成：
实验步骤： 注意：实验之前建议选择2-3 个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。 一、样本处理（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献） 1、组织：称取约0.2g 样本于玻璃管，将组织尽量剪碎以便消化，盖子稍松不密闭。加入2mL 的提取液，煮沸或110℃烘箱2 至6 小时消化至没有可见大的团块，冷却后用10mol/L NaOH（约1mL）调节pH 值至6-8 范围内（不可过酸或过碱），再蒸馏水定容至4mL。最后16000rpm，25℃，离心20min（若离心后仍有杂质，可通过过滤去除），取上清待测。（过程中可能有黑色物质生成，若长时间不能消化，可能为碳化的物质，不影响实验） 2. 细胞：取500 万个细胞，加入1mL 的提取液，煮沸或110℃烘箱2 至6 小时消化至透明状，冷却后用10mol/LNaOH（约0.5mL）调节pH 值至6-8 范围内（不可过酸或过碱），蒸馏水定容至2mL，16000rpm，25℃，离心20min，取上清待测。 二、试剂准备 1. 提取液：自备6 mol/L 盐酸，提供一个125mL 空瓶。6 mol/L 盐酸的配制：浓盐酸（37%）和H2O 的体积比是1：1。 2. 标准品：0.5 mg/mL 羟脯氨酸标准品。 三、测定步骤 1、分光光度计或酶标仪预热30min 以上，调节波长至560nm，蒸馏水调零。 2、将标准品用蒸馏水稀释为30、15、7.5、3.75、1.875、0.938、0.469、0.234 μg/mL 的标准溶液。 3、按下表进行操作：
四、羟脯氨酸含量计算公式 1. 标准曲线的绘制： 以标准溶液的浓度为x 轴，ΔA 标准（ΔA 标准=A 标准管-A 空白管）为y 轴，绘制标准曲线，得到方程y=kx+b。将ΔA 测定（ΔA 测定=A 测定管-A 空白管）带入方程得到x（μg/mL）。 2. 羟脯氨酸含量的计算： （1）按样本质量计算： 组织羟脯氨酸含量（μg/g 质量）= x×V 样本÷（W×V 样本÷V 组提） （2）按样本蛋白浓度计算： 组织羟脯氨酸含量（μg/mg prot）= x×V 样本÷（Cpr×V 样本） （3）按细菌或细胞数量计算： 细胞羟脯氨酸含量（μg/104cell）= x×V 样本÷（细胞数量×V 样本÷V 胞提） V 样本：加入的样本体积； V 组提：组织提取液体积； V 胞提：细胞提取液体积； W：样本质量，g； 细胞数量：以104为单位，万个； Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL。 注意事项： 1、如果测定吸光值超过线性范围吸光值，可以增加样本量或者稀释样本后再进行测定。 2、试剂有一定的毒性，请操作时做好防护措施，防止吸入或与皮肤接触。 3、按样本蛋白浓度计算时，需单独提取样本中的蛋白质并测定。 本试剂盒仅供科研使用! |
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