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Cat. Number

HK21369-24S

Chemical Name

HK21369-24S 柠檬酸合酶(CS)测试盒(可见分光光度法)

Qty 1

50T/24S

References

柠檬酸合酶CS（EC 2.3.3.1）广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞的线粒体基质中，是三羧酸循环第一个限速酶，是三羧酸循环主要调控位点之一。

测定原理：

CS 催化乙酰CoA 和草酰乙酸产生柠檬酰辅酶A，进一步水解产生柠檬酸；该反应促使无色的DTNB 转变成黄色的TNB，在 412nm 处有特征吸光值。

需自备的仪器和用品：

可见分光光度计、低温离心机、水浴锅、研钵/匀浆器、可调节移液器、1mL玻璃比色皿和蒸馏水。

产品组成：

试剂名称	规格	保存条件
提取液	液体×1 瓶	-20℃
试剂R1	液体×1 瓶	2-8℃
试剂R2	液体×1 瓶	-20℃
试剂R3	液体×1 瓶	2-8℃
试剂R4	液体×1 瓶	2-8℃
试剂R5	粉剂×4 支	-20℃
试剂R6	粉剂×2 支	-20℃

实验步骤：

注意：实验之前建议选择2-3 个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。

一、样本处理（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献）

1、组织、细菌或细胞中胞浆蛋白与线粒体蛋白的分离：

1) 称取约0.1g组织或收集500万细胞，加入1mL提取液和10μL试剂R2，用冰浴匀浆器或研钵匀浆。

2) 将匀浆液600g，4℃离心5min。将上清液移至另一离心管中，11000g，4℃离心10min。

3) 上清液即胞浆提取物，可用于测定从线粒体泄漏的CS。

4) 在沉淀中加入200μL试剂R1和2μL试剂R2，反复吹打充分混匀，用于CS测定，并用于蛋白浓度测定。

二、试剂准备

1、试剂R5：临用前加入500 μL 双蒸水，用不完的试剂仍-20℃保存；

2、试剂R6：临用前加入1.5 mL 双蒸水，用不完的试剂仍-20℃保存。

三、测定步骤

1、分光光度计预热30min以上，调节波长至412nm，蒸馏水调零。

2、试剂R3置于25℃（一般物种）或者37℃（哺乳动物）水浴中预热10min左右（保证无沉淀）。

3、操作表：在1mL玻璃比色皿中分别加入

试剂名称	测定管	对照管
试剂R3	860	930
试剂R4	35	35
试剂R5	35	-
样本	35	35
试剂R6	35	-

将上述试剂按顺序加入1mL玻璃比色皿中，加试剂R6的同时开始计时，记录412nm波长下10秒时的初始吸光度A1，之后迅速将比色皿连同反应液一起放入37℃（哺乳动物）或25℃（其它物种）水浴中准确反应2分钟（96孔板放入恒温箱中）；迅速取出比色皿并擦干，412nm下记录2分10秒时的吸光度A2，并计算测定管的ΔA1=A2-A1，对照管的ΔA1’=A2-A1，ΔA=ΔA1-ΔA1’。

四、CS 活性计算

按样本蛋白浓度计算

单位的定义：37℃或25℃下每mg组织蛋白在反应体系中每分钟催化产生1nmol TNB定义为一个酶活力单位。

CS（U/mg prot）=ΔA÷（ε×d）×V反总÷（Cpr×V样本）÷T

ε：TNB的消光系数，13.6×10^-3mL/(nmol·cm)；

V反总：反应体系总体积；

d：比色皿光径，1cm；

V样本：加入的样本体积；

T：反应时间，2min；

Cpr：样本蛋白浓度，mg/mL。

注意事项：

1、测定过程中样本和所有试剂在冰上放置，以免变性和失活。