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Cat. Number
HK21347-48S
Chemical Name
HK21347-48S 磷脂酶D(PLD)测试盒(可见分光光度法)
Qty 1
50T/48S
References

磷脂酶D(EC3.1.4.4)即磷脂酰胆碱水解酶,是催化磷酸二酯键水解和碱基交换反应的一类酶的总称,广泛存在于高等动植物和细菌等多种生物体中,具有参与细胞脂质代谢、信号传导、生物膜形成的抗逆境胁等生理功能。


测定原理:

磷脂酶D催化水解磷脂酰胆碱末端的磷脂酰二酯键生成磷脂酸和胆碱,胆碱在胆碱氧化酶催化作用下生成甜菜碱和过氧化氢,过氧化氢在过氧化氢酶的作用下将4-氨基安替比林和重蒸酚氧化成粉红色物质,在500nm处有特征吸收峰。


需自备的仪器和用品:

可见分光光度计、水浴锅、超速冷冻离心机、可调式移液枪、天平、1mL玻璃比色皿、研钵/匀浆器/细胞超声破碎仪、蒸馏水、无水乙醇和冰。


产品组成:

试剂名称规格保存条件
提取液1液体×1瓶2-8℃
提取液2液体×1支-20℃
试剂R1
液体×1瓶2-8℃
试剂R2液体×1瓶2-8℃
试剂R3粉剂×2瓶2-8℃
试剂R4液体×1瓶2-8℃
标准品液体×1支2-8℃


实验步骤:

注意:实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。

一、样本处理(可适当调整待测样本量,具体比例可以参考文献)

1、组织:按照质量(g)∶提取液1体积(mL)为1:5~10的比例加入提取液,建议称取约0.1g样本,加入0.99m提取液1和0.0lmL提取液2,冰浴匀浆后于4℃,10000g 离心5min;取全部上清于4℃、100000g离心30min,弃上清,取沉淀溶于1mL试剂R1。

2、细胞:按照细胞数量(104个):提取液体积(mL)为500~1000:1的比例(建议500万细胞加入0.99mL提取液1和0.01mL提取液2),冰浴超声波破碎细胞(功率300w,超声3秒,间隔7秒,总时间3min);然后于4℃,10000g离心5min;取全部上清于4℃、100000g离心30min,弃上清,取沉淀溶于1mL 试剂R1。

3、血清(浆):直接测定。

二、试剂准备

1.提取液2:试剂易挥发,用完后快速拧盖,封口膜缠口;

2.试剂R3:试剂放于试剂瓶内玻璃管中临用前取一支加入3mL乙醇充分溶解后取上清使用;2-8℃可以分装保存2周,避免反复冻融;

3.标准品:50umol/mL胆碱溶液,临用前用试剂R1稀释100 倍即500nmol/mL标准溶液备用(可以取10uL 50umol/mL胆碱溶液加入990uL试剂R1混匀即500nmol/mL标准溶液)。

三、测定步骤

1、可见分光光度计预热30min以上,调节波长到500nm,蒸馏水调零。

2、样本测定:


试剂名称(uL)空白管标准管测定管
试剂R1100--
试剂R2150150150
标准品-100-
样本--100
试剂R3100100100
                                       充分混匀,30C反应30min,沸水浴5min,打开盖子,自然冷却2min。
试剂R4
700700700
30℃反应30min,测定500nm处吸光值,分别记为A空白管、A标准管和A测定管。计算△A标准=A标准管-A空白管,△A测定=A测定管-A空白管。空白管和标准管只需做1-2次。


四、酶活计算

1、按蛋白浓度计算

酶活定义:每毫克蛋白每分钟水解磷脂酰胆碱产生1nmol胆碱所需的酶量一个酶活力单位。

PLD活性(U/mg prot)=△A测定÷△A标准×C标准×V提取÷(Cpr×V提取)÷T

2、按样本质量计算

酶活定义:每克组织每分钟水解磷脂酰胆碱产生1nmol胆碱所需的酶量一个酶活力单位

PLD活性(U/g鲜重)=△A测定÷△A标准×C标准×V提取÷W÷T

3、按细菌或细胞数量计算

酶活定义:每104个细胞每分钟水解磷脂酰胆碱产生1nmol胆碱所需的酶量一个酶活力单位。

PLD活性(U/104 cell)=△A测定÷△A标准×C标准xV提取÷细胞数量÷T

4、按血清(浆)计算:

酶活定义:每毫升血清每分钟水解磷脂酰胆碱产生1nmol胆碱所需的酶量一个酶活力单位。

PLD活性(U/mL)=△A测定÷△A标准×C标准×V血清(浆)÷V血清(浆)÷T

C标准:标准液浓度;

V提取:加入的提取液体积(提取液1+提取液2);

V血清(浆):血清(浆)体积;

W:样本质量,g;

细胞数量:以万计;

Cpr:样本蛋白浓度,mg/mL;

T:反应时间,30min。


注意事项:

1. 显色完成后,若有沉淀,于8000g,25℃离心5min后取上清测定。

2. 吸光值不宜超过1,否则用试剂一将酶液进行稀释,并在计算公式中乘以稀释倍数。


本试剂盒仅供科研使用!

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