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| Cat. Number | HK21342-96S |
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| Chemical Name | HK21342-96S 磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(PEPCK)测试盒(酶标板法) |
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| Qty 1 |
100T/96S |
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| References | 磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶PEPCK（EC 4.1.1.32）广泛存在于动物、开花植物、藻类、部分真菌和细菌中。该酶催化草酰乙酸转化为磷酸烯醇式丙酮酸，是调节糖异生途径的第一限速酶。 测定原理： PEPCK催化草酰乙酸生成磷酸烯醇式丙酮酸和CO2，丙酮酸激酶和乳酸脱氢酶进一步依次催化NADH氧化生成NAD+，在340nm下测定NADH下降速率，即可反映PEPCK活性。 需自备的仪器和用品： 紫外分光光度计/酶标仪、低温离心机、水浴锅、微量石英比色皿/96孔UV板、可调式移液枪、研钵/匀浆器、冰和蒸馏水。 产品组成：
实验步骤： 注意：实验之前建议选择2-3 个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。 一、样本处理（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献） 组织：按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为1：5~10 的比例（建议称取约0.1g 组织，加入1mL 提取液）进行冰浴匀浆，然后8000g，4℃，离心10min，取上清，置冰上待测。 细菌或培养细胞：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照细菌或细胞数量（104 个）：提取液体积（mL）为500~1000：1 的比例（建议500 万细菌或细胞加入1mL 提取液），超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率20%或200W，超声3s，间隔10s，重复30 次）；8000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。 血清（浆）样本：直接检测。 二、试剂准备 1、试剂R2：临用前加入15 mL 试剂R1溶解。可溶解后分装-20℃保存，避免反复冻融。 2、试剂R3：液体置于试剂瓶内EP 管内。临用前加入蒸馏水按体积比1：120 稀释，现用现配。 3、试剂R4：液体置于试剂瓶内EP 管内。临用前加入蒸馏水按体积比7：250 稀释，现用现配。 4、试剂R5：粉剂置于试剂瓶内玻璃管内。临用前加入2.5 mL 蒸馏水充分溶解；可溶解后分装-20℃保存，避免反复冻融。 5、工作液的配制：将试剂R2、试剂R3、试剂R4按7:1:1（V:V:V）的比例配制工作液，工作液现用现配。 三、测定步骤 1、紫外分光光度计/酶标仪预热30min以上，调节波长至340nm，蒸馏水调零。 2、将工作液置于37℃(哺乳动物)或25℃(其它物种)预热5分钟。 3、操作表：在微量石英比色皿/96孔UV板中依次加入下列试剂：
四、PEPCK酶活计算 A 按微量石英比色皿计算： 1、按蛋白浓度计算 酶活定义：每mg组织蛋白每分钟消耗1 nmol 的NADH定义为一个酶活力单位。 PEPCK酶活（U/mg prot）= ΔA÷（ε×d）×109×V反总÷（V样×Cpr）÷T 2、按样本质量计算 酶活定义：每g组织每分钟消耗1 nmol 的NADH定义为一个酶活力单位。 PEPCK酶活（U/g 质量）= ΔA÷（ε×d）×109×V反总÷（V样×W÷V样总）÷T 3、按细菌或细胞数量计算 酶活定义：每104个细菌或细胞每分钟消耗1 nmol 的NADH定义为一个酶活力单位。 PEPCK酶活（U/104 cell）= ΔA÷（ε×d）×109×V反总÷（500×V样÷V样总）÷T 4、按血清（浆）体积计算 酶活定义：每毫升血清（浆）每分钟消耗1 nmol 的NADH定义为一个酶活力单位。 PEPCK（U/mL）＝ΔA÷（ε×d）×109×V反总÷V样÷T ε：NADH摩尔消光系数，6.22×103 L/mol/cm； d：比色皿光径，1cm； V反总：反应体系总体积； V样：反应体系中样本体积； V样总：加入提取液体积； Cpr：样本蛋白浓度，mg/mL，蛋白浓度自行测定； W：样本质量，g； T：反应时间：1min； 500：细菌或细胞总数，500万； 109：单位换算系数，1mol=109nmol。 B 按96孔UV板计算： 将上述公式中的d-1cm改为d-0.6cm（96孔板光径）进行计算即可。 注意事项： 1、当A1 小于1 或ΔA 大于0.6 时（96 孔UV 板是当A1 小于0.6 或ΔA 大于0.4 时），建议将样本稀释适当倍数后再进行测定，以提高检测灵敏度。 2、酶活性高的样本如动物肝、肾等组织，建议将提取液稀释5 倍或5 倍以上测定。 3、空白管为检测各试剂组分质量的检测孔，正常情况下，变化不超过0.06。 4、加样、混匀等步骤要迅速，秒表计时要准确。 本试剂盒仅供科研使用! |
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