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| Cat. Number | HK21338-96S |
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| Chemical Name | HK21338-96S 磷酸果糖激酶(PFK)测试盒(酶标板法) |
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| Qty 1 |
100T/96S |
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| References | 磷酸果糖激酶（Phosphofructokinase，PFK，EC 2.7.1.11)广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中，负责将果糖-6-磷酸和ATP转化为果糖二磷酸和ADP，是糖酵解过程的关键调节酶之一。 测定原理： PFK催化果糖-6-磷酸和ATP生成果糖-1,6-二磷酸和ADP，丙酮酸激酶和乳酸脱氢酶进一步依次催化NADH氧化生成NAD+，在340nm下测定NADH下降速率，即可反映PFK活性。 需自备的仪器和用品: 紫外分光光度计/酶标仪、水浴锅/恒温培养箱、台式离心机、可调式移液器、微量石英比色皿/96孔UV板、研钵/匀浆器/细胞超声破碎仪、冰和蒸馏水。 产品组成：
实验步骤: 注意:实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。 一、样本处理（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献) 1. 细菌或培养细胞：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照细菌或细胞数量（104个)：提取液体积(mL)为500-1000: 1的比例(建议500万细菌或细胞加入1mL提取液)，超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率200W，超声 3s，间隔10s，重复30次)；8000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。 2. 组织：按照组织质量(g)∶提取液体积(mL)为1:5-10的比例(建议称取约0.1g组织，加入1mL提取液)，进行冰浴匀浆；8000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。 3. 血清（浆）等其他液体：直接检测。若有沉淀请离心后取上清待测。 二、试剂准备 1、试剂R2A：临用前加入1mL蒸馏水，用不完的试剂-20°C分装保存4周，避免反复冻融； 2、试剂R2B：临用前加入1mL蒸馏水，用不完的试剂-20°C分装保存4周，避免反复冻融； 3、试剂R2C：临用前取一支加入0.5mL蒸馏水，用不完的试剂-20°C分装保存2周，避免反复冻融； 4、试剂R2D：临用前加入1mL蒸馏水，用不完的试剂-20°C分装保存4周，避免反复冻融； 5、试剂R3：临用前根据用量按照试剂R3：蒸馏水为1uL：50uL(约5T）的体积比例充分混匀，现用现配； 6、试剂R4：临用前根据用量按照试剂R4：蒸馏水为1uL：125uL(约12T)的体积比例充分混匀，现用现配； 7、工作液的配制：根据样本量按试剂R1：试剂R2A：试剂R2B：试剂R2C：试剂R2D=8mL: 0.5mL: 0.5mL：0.5mL: 0.5mL（约55T)的比例配制工作液，现用现配。 三、测定步骤 1. 紫外分光光度计/酶标仪预热30min以上，调节波长至340nm，分光光度计蒸馏水调零。 2. 工作液临用前于37℃(哺乳动物）或25°℃（其它物种）预热10min。 3. 操作表：
将上述试剂按顺序加入微量石英比色皿或96孔UV板中，立即充分混匀后于340nm处测定20s时的吸光值A1，迅速置于37C（哺乳动物）或25℃(其它物种）准确反应10min(酶标仪有控温功能可将温度调至37C拿出迅速擦干测定10min20s时的吸光值A2。计算ΔA=A1-A2。 四、PFK活性的计算 a.用微量石英比色皿测定的计算公式如下： 1、血清（浆）PFK活性的计算： 单位的定义：每毫升血清（浆）在反应体系中每分钟催化1nmol NADH转化为1nmol NAD*定义为一个酶活性单位。 PFK活性(U/mL）=[ΔA×V反总÷(ε×d) ×109]÷V样÷T 2、组织、细菌或细胞中 PFK活性的计算: (1）按样本蛋白浓度计算 单位的定义：每mg组织蛋白在反应体系中每分钟催化1nmol NADH转化为1nmol NAD*定义为一个酶活性单位。 PFK活性（U/mg prot）=[ΔAxV反总÷(εxd)×109]÷(Cpr×V样)÷T (2）按样本质量计算 单位的定义：每g组织在反应体系中每分钟催化 1nmol NADH转化为1nmol NAD*定义为一个酶活性单位。 PFK活性（U/g 质量）=[ΔAxV反总÷(ε×d)×109]÷(W×V样÷V样总)÷T (3）按细菌或细胞数量计算 单位的定义：每1万个细菌或细胞在反应体系中每分钟催化1nmol NADH转化为1nmol NAD*定义为一个酶活性单位。 PFK活性（U/104 cell）=[ΔAxV反总÷(εxd)×109]÷(500×V样÷V样总)÷T V反总：反应体系总体积; E：NADH摩尔消光系数，6.22×103L/mol/cm; d：比色皿光径，1cm; v样：加入样本体积; V样总：加入提取液体积; T：反应时间，10min; Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL; W：样本质量，g; 500：细菌或细胞总数，500万; 109：单位换算系数，1mol=109nmol。 b.用96孔板测定的计算公式如下： 将上述公式中的d-1cm改为d-0.6cm (96孔板光径）进行计算即可。 注意事项: 1. 测定过程中试剂R3、试剂R4和样本在冰上放置，以免变性和失活。 2. 比色皿中反应液的温度必须保持37℃（哺乳动物）或25℃(其它物种），取小烧杯一只装入一定量的37℃或25°℃蒸馏水，将此烧杯放入37℃或25℃水浴锅中。在反应过程中把比色皿连同反应液放在此烧杯中； 3. 最好两个人同时做此实验，一个人比色，一个人计时，以保证实验结果的准确性。 4. 不同匀浆组织中PFK活性不一样，若ΔA>0.5，则说明活性太高，必须用提取液稀释成适当浓度匀浆上清液，或缩短反应时间至2min或5min，使ΔA<0.5，以提高检测的灵敏度。注意同步修改计算公式。 本试剂盒仅供科研使用! |
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