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| Cat. Number | HK21336-96S |
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| Chemical Name | HK21336-96S 总磷酸丙糖异构酶(TPI)测试盒(酶标板法) |
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| Qty 1 |
100T/96S |
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| References | 植物叶绿体中磷酸丙糖异构酶是光合作用中参与calvin循环的重要酶。作用于磷酸甘油醛和磷酸二羟丙酮之间的转化，磷酸二羟丙酮能快速透过叶绿体的包膜进入细胞质，并在其中逐步转化为蔗糖。 测定原理： 需要的仪器，耗材: 1、紫外分光光度计/酶标仪 2、天平 3、水浴锅 4、台式低温离心机 5、微量石英比色皿/96孔UV板 6、细胞超声破碎仪 7、可调式移液枪 8、研钵/匀浆器 9、冰、蒸馏水。 产品组成：
实验步骤： 注意：实验之前建议选择2-3 个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。 一、样本处理（具体比例可以参考文献） 1. 总TPI 提取：按照组织质量（g）︰提取液1体积(mL)为1︰5~10 的比例（建议称取约0.1g，加入1mL 提取液1）进行冰浴匀浆，匀浆后冰浴超声波破碎（功率200W，超声3s，间隔7s，总时间1min），于4℃，8000g离心10min，取上清，置于冰上待测。 2. 胞浆和叶绿体TPI 的分离： （1） 按照组织质量（g）：提取液1体积(mL)为1︰5~10 的比例（建议称取约0.1g，加入1mL 提取液1）进行冰浴匀浆，匀浆后于4℃，200g 离心5min，弃沉淀，留取上清。 （2） 上清于4℃，8000g 离心10min，取上清用于测定胞浆TPI 活性， （3） 在第二步离心后的沉淀加1mL 提取液2，震荡混匀后冰浴超声波破碎（功率200W，超声3s，间隔7s，总时间1min），然后4℃，8000g 离心10min，取上清测定叶绿体中TPI 活性。 建议测定总TPI 活性，按照步骤1 提取粗酶液，若需要分别测定胞浆和叶绿体中的TPI，则按照步骤2 提取粗酶液。 二、试剂准备 1、试剂R2：临用前取1 支加入1.1mL 蒸馏水，充分溶解；用不完的试剂-20℃分装保存4 周，避免反复冻融； 2、试剂R3：临用前取1 支加入1.1mL 蒸馏水，充分溶解；用不完的试剂-20℃分装保存4 周，避免反复冻融； 3、试剂R4：提供1个8mL 棕色空试剂瓶。临用前取1 支试剂R4加入2.5mL 蒸馏水，充分溶解；用不完的试剂-20℃分装保存2 周，避免反复冻融。 三、测定步骤 1. 紫外分光光度计/酶标仪预热30min 以上，调节波长至340nm，分光光度计蒸馏水调零。 2. 试剂R1预热15min 以上。 3. 测定管： 依次取120μL 试剂R1、20μL 试剂R2、20μL 试剂R3、20μL 试剂R4和20μL 粗酶液于微量石英比色皿或96 孔UV 板，迅速吹打混匀，立即记录340nm 处20s 的吸光值A1，迅速置于37℃水浴锅或培养箱5min（酶标仪有控温功能的可以将温度调至37℃），拿出迅速擦干测定5min20s 时的吸光值A2，计算ΔA=A2-A1。 四、磷酸丙糖异构酶活性计算 A、使用微量石英比色皿测定 1. 按样本蛋白浓度计算 酶活单位定义：每mg 组织蛋白每min 生成1 nmol 的NADH 定义为一个酶活力单位。 TPI 活性（U/mg prot）＝(ΔA÷ε÷d)×V 反×109÷V 样÷Cpr÷T×F 2. 按照样本质量计算 酶活单位定义：每g 组织每min 生成1 nmol 的NADH 定义为一个酶活力单位。 TPI 活性（U/g 质量）＝(ΔA÷ε÷d)×V 反×109÷V 样×V 提÷W÷T×F ε：NADH 摩尔消光系数，6.22×103 L/mol/cm； d：比色皿光径，1cm； 109：单位换算系数，1mol=109nmol； V反：反应总体积； V 样：加入样本上清体积； V 提：加入提取液1或提取液2的体积； W：样本质量，g； Cpr：样本蛋白浓度，mg/mL； T：反应时间，5min； F：稀释倍数。 B、使用96 孔UV 板测定 将上述公式中的d-1cm改为d-0.6cm（96孔UV板光径）进行计算即可。 本试剂盒仅供科研使用! |
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