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| Cat. Number | HK21327-96S |
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| Chemical Name | HK21327-96S 抗坏血酸氧化酶(AAO)活性测试盒(酶标板法) |
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| Qty 1 |
100T/96S |
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| References | 抗坏血酸氧化酶AAO是定位于植物细胞壁的糖蛋白，属“蓝铜氧化酶”家族。细胞壁内的抗坏血酸和AAO与细胞壁的代谢和生长有着密切的联系。AAO氧化AsA所形成的MDHA可通过质膜上的细胞色素b还原，该过程中电子的跨膜运输能够促进细胞生长。 测定原理： AAO可直接氧化AsA，通过测定AsA的氧化量，可计算得AAO活力。 需自备的仪器和用品： 低温离心机、紫外分光光度计/酶标仪、微量石英比色皿/96孔板（UV板）、可调式移液器、研钵/匀浆器、冰、蒸馏水。 产品组成：
实验步骤： 注意：实验之前建议选择2-3 个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。 一、样本处理（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献） 称取约0.1g 样本，加提取液1mL，冰上充分研磨，11000g 4℃离心20min，取上清液待测。 二、试剂准备 1、试剂R2：临用前加入10 mL 蒸馏水充分溶解。 三、测定步骤 1、分光光度计/酶标仪预热30min，调节波长到265nm，蒸馏水调零。 2、试剂R1在25℃水浴锅中预热30min。 3、按下表依次在微量石英比色皿/96孔板中加入试剂
迅速混匀后在265nm 测定10s 和130s 的吸光值，分别为A1、A2，用A1 减A2，得到ΔA 空白管、ΔA 测定管。 四、AAO活性计算 a.使用微量石英比色皿测定的计算公式如下 （1）按蛋白浓度计算 AAO活性单位定义：25℃中每毫克蛋白每分钟氧化1μmol AsA为1个酶活单位。 AAO(U/mg prot) = (ΔA测定管-ΔA空白管)÷（ε×d）×V反总×106÷(Cpr×V样)÷T （2）按样本质量计算 AAO活性单位定义：25℃中每克样本每分钟氧化1μmol AsA为1个酶活单位。 AAO(U/g 质量) = (ΔA测定管-ΔA空白管)÷（ε×d）×V反总×106÷(V样÷V样总×W)÷T ε：AsA在265nm处消光系数，5.42×104L/mol/cm； d：比色皿光径，1cm； V反总：反应体系总体积； 106：单位换算系数，1mol=1×106μmol； Cpr：上清液蛋白质浓度（mg/mL），需要另外测定； W：样本质量，g； V样：加入反应体系中上清液体积； V样总：提取液体积； T：催化反应时间，2min。 b.使用96孔板测定的计算公式如下 （1）按蛋白浓度计算 AAO活性单位定义：25℃中每毫克蛋白每分钟氧化1μmol AsA为1个酶活单位。 AAO(U/mg prot) = (ΔA测定管-ΔA空白管)÷（ε×d）×V反总×106÷(Cpr×V样)÷T （2）按样本质量计算 AAO活性单位定义：25℃中每克样本每分钟氧化1μmol AsA为1个酶活单位。 AAO(U/ g 质量) = (ΔA测定管-ΔA空白管)÷（ε×d）×V反总×106÷(V样÷V样总×W)÷T =0.1538×(ΔA测定管-ΔA空白管) ÷W ε：AsA在265nm处消光系数，5.42×104L/mol/cm； d：96孔板光径，0.6cm； V反总：反应体系总体积； 106：单位换算系数，1mol=1×106μmol； Cpr：上清液蛋白质浓度（mg/mL），需要另外测定； W：样本质量，g； V样：加入反应体系中上清液体积； V样总：提取液体积，1mL； T：催化反应时间，2min。 注意事项： 由于试剂R1中含有一定浓度的蛋白（约1mg/mL），所以在测定样本蛋白浓度时需要减去提取液本身的蛋白含量。 本试剂盒仅供科研使用! |
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