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| Cat. Number | HK21313-96S |
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| Chemical Name | 己糖激酶(HK)测试盒(酶标板法) |
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| Qty 1 |
100T/96S |
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| References | 己糖激酶HK（EC 2.7.1.1）广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中，是葡萄糖分解过程中的第一个关键酶，催化葡萄糖转化为6-磷酸葡萄糖，6-磷酸葡萄糖是糖酵解和磷酸戊糖途径的交叉点。 测定原理： HK催化葡萄糖合成6-磷酸葡萄糖，6-磷酸葡萄糖脱氢酶进一步催化6-磷酸葡萄糖脱氢生成NADPH，NADPH在340nm有特征吸收峰。 需自备的仪器和用品: 紫外分光光度计/酶标仪、水浴锅/恒温培养箱、台式离心机、可调式移液器、微量石英比色皿/96孔UV板、研钵/匀浆器/细胞超声破碎仪、冰和蒸馏水。 产品组成：
实验步骤: 注意:实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。 一、样本处理（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献) 1. 细菌或培养细胞：收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清，按照细菌或细胞数量〈（10+个):提取液体(mL)为500-1000: 1的比例(建议500万细菌或细胞加入lmL 提取液)，超声波破碎细菌或细胞（冰沁功率200W，超声3s，间隔10s，重复30次)，8000g 4C离心10min，取上清，置冰上待测。 2.组织：按照组织质量(g)：提取液体积(mL)为1:5-10的比例(建议称取约0.1g组织，加入lmL提取液)进行冰浴匀浆;8000g 4C离心10min，取上清，置冰上待测。 3.血清（浆）等液体样本：直接检测。若有沉淀请离心后取上清待测。 二、试剂准备 1. 试剂R2B：临用前加入12mL试剂R1溶解，用不完的试剂2-8℃分装保存4周； 2. 试剂R2C：临用前加入4mL试剂R1溶解，用不完的试剂-20℃分装保存4周，避免反复冻融； 3. 试剂R2D：临用前加入4mL试剂R1溶解，用不完的试剂-20℃分装保存4周，避免反复冻融； 4. 试剂R2的配制：根据样本量按试剂R2A：试剂R2B：试剂R2C：试剂R2D =100μL：500μL：150μL：150μL（5T）的比例配制成试剂二，现用现配； 5. 试剂R3：临用前取1支，加入0.5 mL试剂R1，充分溶解；用不完的试剂-20℃保存2周，避免反复冻融。 三、测定步骤 1、紫外分光光度计或酶标仪预热30min以上，调节波长至340nm，紫外分光光度计蒸馏水调零。 2、试剂R2临用前于37℃(哺乳动物）或25°℃（其它物种）预热10min。 3、加样表:
将上述试剂按顺序加入微量石英比色皿或96孔UV板中，立即充分混匀后于340nm处测定20s时的吸光值A1，迅速置于37℃（哺乳动物）或25℃（其它物种）准确反应5min（酶标仪有控温功能可将温度调至37℃），拿出迅速擦干测定5min20s时的吸光值A2，记录340nm下20s时吸光值A1和5min后的吸光值A2。计算ΔA=A2-A1。 四、HK 活性计算 A、用微量石英比色皿测定的计算公式如下 1． 血清（浆）HK活性 单位的定义：每毫升血清（浆）在每分钟生成1nmol的NADPH定义为一个酶活力单位。 HK活性（U/mL）=[ΔA×V 反总÷（ε×d）×109]÷V样÷T 2． 组织、细菌或细胞中HK活性 （1）按样本蛋白浓度计算 单位的定义：每mg 组织蛋白每分钟生成1nmol的NADPH定义为一个酶活力单位。 HK活性（U/mg prot）=[ΔA×V 反总÷（ε×d）×109]÷(V样×Cpr) ÷T （2）按样本质量计算 单位的定义：每g 组织每分钟生成1nmol的NADPH定义为一个酶活力单位。 HK活性（U/g 质量）=[ΔA×V 反总÷（ε×d）×109]÷(W ×V样÷V样总) ÷T （3）按细菌或细胞数量计算 单位的定义：每1万个细菌或细胞每分钟生成1nmol的NADPH定义为一个酶活力单位。 HK活性（U/104 cell）=[ΔA×V 反总÷（ε×d）×109]÷(500×V样÷V样总) ÷T V反总：反应体系总体积，2×10-4 L； ε：NADPH 摩尔消光系数，6.22×103 L/mol/cm； d：比色皿光径，1cm； V样：加入样本体积； V样总：加入提取液体积； T：反应时间，5min； Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL； W：样本质量，g； 500：细菌或细胞总数，500万。 B、 用96孔UV板测定的计算公式如下 1. 血清（浆）HK活性 单位的定义：每毫升血清（浆）在每分钟生成1nmol的NADPH定义为一个酶活力单位。 HK活性（U/mL）=[ΔA×V反总÷（ε×d）×109]÷V样÷T 2. 组织、细菌或细胞中HK活性 （1）按样本蛋白浓度计算 单位的定义：每mg组织蛋白每分钟生成1nmol的NADPH定义为一个酶活力单位。 HK活性（U/mg prot）=[ΔA×V反总÷（ε×d）×109]÷(V样×Cpr) ÷T （2）按样本质量计算 单位的定义：每g组织每分钟生成1nmol的NADPH定义为一个酶活力单位。 HK活性（U/g 质量）=[ΔA×V反总÷（ε×d）×109]÷(W× V样÷V样总) ÷T （3）按细菌或细胞数量计算 单位的定义：每1万个细菌或细胞每分钟生成1nmol的NADPH定义为一个酶活力单位。 HK活性（U/104 cell）=[ΔA×V反总÷（ε×d）×109]÷(500×V样÷V样总)÷T V反总：反应体系总体积，2×10-4 L； ε：NADPH摩尔消光系数，6.22×103 L/mol/cm； d：96孔板光径，0.6cm； V样：加入样本体积； V样总：加入提取液体积； T：反应时间，5min； Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL； W：样本质量，g； 500：细菌或细胞总数，500万。 注意事项: 1. 比色皿中反应液的温度必须保持37C（哺乳动物）或25°℃(其它物种)，取小烧杯一只装入一定量的37℃或25℃蒸馏水，将此烧杯放入37℃或25℃水浴锅中。在反应过程中把比色皿连同反应液放在此烧杯中。 2.最好两个人同时做此实验，一个人比色，一个人计时，以保证实验结果的准确性。 3． 不同匀浆组织中HK活力不一样，做正式试验之前请做1-2次预试验，若AA>0.5，则说明组织活力太高，必须用提取液稀释成适当浓度匀浆上清液，或缩短反应时间至2min，使AA<0.5，以提高检测灵敏度。注意同步修改计算公式。 本试剂盒仅供科研使用! |
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