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Cat. Number

HK21312-48S

Chemical Name

己糖激酶(HK)测试盒(可见分光光度法)

Qty 1

50T/48S

References

己糖激酶HK（EC 2.7.1.1）广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中，是葡萄糖分解过程中的第一个关键酶，催化葡萄糖转化为6-磷酸葡萄糖，6-磷酸葡萄糖是糖酵解和磷酸戊糖途径的交叉点。

测定原理：

HK催化葡萄糖合成6-磷酸葡萄糖，6-磷酸葡萄糖脱氢酶进一步催化6-磷酸葡萄糖脱氢生成NADPH，NADPH在340nm有特征吸收峰。

需自备的仪器和用品:

紫外分光光度计/酶标仪、水浴锅/恒温培养箱、台式离心机、可调式移液器、微量石英比色皿/96孔UV板、研钵/匀浆器/细胞超声破碎仪、冰和蒸馏水。

产品组成：

试剂名称	规格	保存条件
提取液	液体×1 瓶	2-8℃
试剂R1	液体×1 瓶	2-8℃
试剂R2	液体×1 瓶	2-8℃
试剂R3	粉剂×1 瓶	2-8℃
试剂R4	粉剂×1 瓶	-20℃
试剂R5	粉剂×1 瓶	-20℃
试剂R6	粉剂×2 支	-20℃

实验步骤:

注意:实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。

一、样本处理（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献)

1. 细菌或培养细胞：收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清，按照细菌或细胞数量（10⁴个)：提取液体(mL)为500-1000: 1的比例(建议500万细菌或细胞加入1mL 提取液)，超声波破碎细菌或细胞（冰沁功率200W，超声3s，间隔10s，重复30次)，8000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。

2.组织：按照组织质量(g)：提取液体积(mL)为1:5-10的比例(建议称取约0.1g组织，加入lmL提取液)进行冰浴匀浆；8000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。

3.血清（浆）等液体样本：直接检测。若有沉淀请离心后取上清待测。

二、试剂准备

1、试剂R2：临用前加入30 mL蒸馏水充分溶解备用，用不完的试剂4℃保存4周;

2、试剂R4：临用前加入5mL蒸馏水充分溶解备用，用不完的试剂-20°C分装保存4周;

3、试剂R5：临用前加入3mL蒸馏水充分溶解备用，用不完的试剂-20°C分装保存4周;

4、试剂R6：临用前取1支试剂R6加入125 uL 试剂R1和125 uL蒸馏水充分溶解备用，用不完的试剂4℃保存2周。

三、测定步骤

1、紫外分光光度计或酶标仪预热30min以上，调节波长至340nm，紫外分光光度计蒸馏水调零。

2、将试剂R1、R2、R3、R4和R5置于37℃（哺乳动物）或25℃（其他物种）预热10min。

3、加样表:

试剂名称	测定管
试剂R1	400
试剂R2	400
试剂R3	80
试剂R4	80
试剂R5	40
试剂R6	8
样本	30

将上述试剂按顺序加入1吗L石英比色皿中，立即充分混匀后于340nm处测定20s时的吸光值A1，迅速置于37℃（哺乳动物）或25℃（其它物种）准确反应5min（酶标仪有控温功能可将温度调至37℃），拿出迅速擦干测定5min20s时的吸光值A2，记录340nm下20s时吸光值A1和5min后的吸光值A2。计算ΔA=A2-A1。

四、HK 活性计算

1．血清（浆）HK活性

单位的定义：每毫升血清（浆）在每分钟生成1nmol的NADPH定义为一个酶活力单位。

HK活性（U/mL）=[ΔA×V 反总÷（ε×d）×109]÷V样÷T

2．组织、细菌或细胞中HK活性

（1）按样本蛋白浓度计算

单位的定义：每mg 组织蛋白每分钟生成1nmol的NADPH定义为一个酶活力单位。

HK活性（U/mg prot）=[ΔA×V 反总÷（ε×d）×109]÷(V样×Cpr) ÷T

（2）按样本质量计算

单位的定义：每g 组织每分钟生成1nmol的NADPH定义为一个酶活力单位。

HK活性（U/g 质量）=[ΔA×V 反总÷（ε×d）×109]÷(W ×V样÷V样总) ÷T

（3）按细菌或细胞数量计算