辅酶Ⅱ NADP(H)广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中，NADP+和 NADPH 含量测定可以计算NADP（NADPH + NADP+)含量和 NADPH/NADP+比值，其变化与磷酸戊糖途径和生物合成以及抗氧化反应密切相关。NADPH/NADP+比值不仅是细胞氧化还原态的主要标志之一，而且在 PPP 途径、生物合成和抗氧化代谢中具有重要调控作用。

测定原理：

分别用酸性和碱性提取液提取样品中NADP+和NADPH。NADPH 通过PMS 的递氢作用，使氧化型噻唑蓝（MTT）还原为甲瓒，570nm 下检测吸光值，从而测定 NADPH 含量。利用6-磷酸葡萄糖脱氢酶还原NADP+为NADPH，从而检测NADP+含量。

需自备的仪器和用品：

可见分光光度计、低温离心机、水浴锅、研钵/匀浆器、超声破碎仪、可调式移液器、1mL玻璃比色皿、冰和蒸馏水。

产品组成：

实验步骤：

注意：实验之前建议选择2-3 个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。

一、样本处理（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献）

1、血清（浆）中NADP+和NADPH 的提取：

NADP+的提取：取0.1mL 血清（浆），加入0.5mL 酸性提取液，煮沸5min (盖紧，以防止水分散失)，冰浴冷却后，10000g 4℃离心10min；取上清200μL，加入等体积碱性提取液；混匀，10000g 4℃离心10min，取上清，冰上保存待测。

NADPH 的提取：取0.1mL 血清（浆），加入0.5mL 碱性提取液，煮沸 5min(盖紧，以防止水分散失)，冰浴冷却后，10000g 4℃离心10min，取上清200μL，加入等体积酸性提取液；混匀，10000g 4℃离心10min，取上清,冰上保存待测。

2、组织中NADP+和NADPH 的提取：

NADP+的提取：称取约0.1g 组织，加入0.5mL 酸性提取液，冰浴研磨，煮沸5min(盖紧，以防止水分散失)，冰浴冷却后，10000g 4℃离心10min，取上清200μL，加入等体积碱性提取液混匀，10000g 4℃离心10min，取上清，冰上保存待测。

NADPH 的提取：称取约0.1g 组织，加入0.5mL 碱性提取液，冰浴研磨，煮沸5min(盖紧，以防止水分散失)，冰浴冷却后，10000g 4℃离心10min，取上清200μL，加入等体积酸性提取液混匀，10000g 4℃离心10min，取上清，冰上保存待测。

3、细胞或细菌中NADP+和NADPH 的提取：

NADP+的提取：收集500 万细胞或细菌，加入0.5mL 酸性提取液，超声波破碎1min（强度20％或200W，超声2s，停1s），煮沸5min(盖紧，以防止水分散失)，冰浴中冷却后，10000g 4 ℃离心10min，取上清液200uL 至另一新的离心管中，加入等体积的碱性提取液使之中和，混匀，10000g 4℃离心10min，取上清，冰上保存待测。

NADPH 的提取：收集500 万细胞或细菌，加入0.5mL 碱性提取液，超声波破碎1min（强度20％或200W，超声2s，停1s），煮沸5min(盖紧，以防止水分散失)，冰浴中冷却后，10000g 4 ℃离心10min，取上清液200uL至另一新的离心管中，加入等体积的酸性提取液使之中和，混匀，10000g 4℃离心10min，取上清，冰上保存待测。

二、试剂准备

1、试剂R2：临用前加入6mL 蒸馏水充分混匀，溶解后4℃保存2-8 周。

2、试剂R4：临用前将试剂R4A 溶解到试剂R4B 中，溶解后加入5mL 蒸馏水，分装保存，避免反复冻融，-20℃ 保存4 周。

3、NADP 标准品：临用前加入 1.27 mL 蒸馏水，即 5 μmol/mL，-20℃可以保存2 周。

4、NADPH 标准品：临用前加入 1.2 mL 蒸馏水，即 5 μmol/mL，-20℃可以保存2 周。

三、测定步骤

1、分光光度计/酶标仪预热30 min 以上，调节波长至570 nm，分光光度计蒸馏水调零。

2、NADP 标准品：用蒸馏水稀释为1.25、0.625、0.3125、0.15625、0.078、0.039、0.0195、0nmol/mL 的标准溶液（0nmol/mL

即空白管）。

3、NADPH 标准品：用蒸馏水稀释为2.5、1.25、0.625、0.3125、0.15625、0.078、0nmol/mL 的标准溶液（0nmol/mL即空白管）。

4、稀释表（附于说明书最后）

5、在EP 管中按顺序加入下列试剂：

混匀，在570nm 下读取吸光值，NADP+的记为：ΔANADP+= A2-A1，NADPH的记为ΔANADPH= A2'- A1'，NADP 标准管的记为ΔA NADP 标=A标-A空白管。NADPH 标准管的记为ΔA NADPH 标=A 标'-A 空白管。（标准曲线只需做1-2 次）

四、NADP+和NADPH 含量计算

1、标准曲线绘制：

（1） NADP+标准曲线的绘制：根据标准管的浓度（x1，nmol/mL）和吸光度ΔA标准（y1，ΔA标准），建立标准曲线。根据标准曲线，将ΔA代入方程得到x1（nmol/mL）。

（2）NADPH标准曲线的绘制：根据标准管的浓度（x2，nmol/mL）和吸光度ΔA标准（y2，ΔA标准），建立标准曲线。根据标准曲线，将ΔA代入方程得到x2（nmol/mL）。

2、NADP+和NADPH含量计算

（一）NADP+含量计算

（1） 按液体体积计算：NADP+含量(nmol/mL）= x1×（V 提取+V 血清）÷V 血清

（2） 按样本蛋白浓度计算 NADP+ (nmol/mg prot）= x1×V 提取÷(V 提取×Cpr)

（3） 按样本鲜重计算NADP+含量(nmol/g 鲜重）= x1×V 提取÷W

（4） 按细胞数量计算：NADP+含量(nmol/10⁴ cell）= x1×V 提取÷500

（二）NADPH 含量计算

（1） 按液体体积计算：NADPH 含量(nmol/mL）= x2×（V 提取+V 血清）÷V 血清

（2） 按样本蛋白浓度计算 NADPH (nmol/mg prot）= x2×V 提取÷(V 提取×Cpr)

（3） 按样本鲜重计算NADPH 含量(nmol/g 鲜重）= x2×V 提取÷W

（4） 按细胞数量计算：NADPH 含量(nmol/104 cell）= x2×V 提取÷500

V提取：加入提取液体积；

V血清：血清（浆）体积；

Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；

W：样本质量，g；

500：细菌或细胞总数，500万。

注意事项：

1、如果一次性测定样本数较多，可将试剂R1、R2、R3按比例配成混合液。

2、反应过程中注意避光。

3、由于每一个测定管需要设一个对照管，本试剂盒50 管可以测定24个NADP+或NADPH。

4、如果测定吸光值超过线性范围吸光值，可以增加样本量或者稀释样本后再进行测定。

本试剂盒仅供科研使用!