服务热线
021-60498804
| Cat. Number | HK21247-48S |
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Chemical Name | 辅酶ⅠNAD(H)含量测试盒(酶标板法) |
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Qty 1 |
100T/48S |
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| References | 辅酶ⅠNAD(H)广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中，NAD+是糖酵解（EMP）和三羧酸循环（TCA）的主要氢受体，生成的NADH经呼吸电子链（ETC）传递把电子交给氧，在合成ATP的同时，形成大量的ROS，同时NADH再生为NAD+。糖、脂、蛋白质三大代谢物质分解中的氧化反应绝大部分通过这一体系完成。NAD(H)含量和NADH/NAD+比值的高低可用于评价糖酵解和TCA循环的强弱。较高的NAD(H)及NADH/NAD+比值说明细胞呼吸耗氧量较高，处于过氧化状态。此外，NADH/NAD+比值升高也可抑制糖酵解和TCA循环。另外，NAD+降解产物对细胞信号传导、代谢和基因表达等具有重要的调控作用。
分别用酸性和碱性提取液提取样品中NAD+和NADH，NADH通过PMS的递氢作用，还原氧化型噻唑蓝（MTT）为甲瓒，在570nm下检测吸光值；而NAD+可被乙醇脱氢酶还原为NADH，进一步采用MTT还原法检测。 需自备的仪器和用品： 可见分光光度计/酶标仪、台式离心机、移液器、微量玻璃比色皿/96 孔板、研钵/匀浆器、冰和蒸馏水。 产品组成：
实验步骤： 注意：实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。 一、NAD+和NADH 的提取（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献） 1、血清（浆）中NAD+和NADH 的提取： NAD+的提取：取0.1mL 血清（浆），加入0.5mL 酸性提取液，煮沸5min (盖紧，以防止水分散失)，冰浴冷却后，10000g 4℃离心10min；取上清200μL，加入等体积碱性提取液；混匀，10000g 4℃离心10min，取上清，冰上保存待测。 NADH 的提取：取0.1mL 血清（浆），加入0.5mL 碱性提取液，煮沸 5min(盖紧，以防止水分散失)，冰浴中冷却后，10000g 4℃离心10min，取上清200μL，加入等体积酸性提取液；混匀，10000g 4℃离心10min，取上清，冰上保存待测。 2、组织中NAD+和NADH 的提取： NAD+的提取：称取约0.1g 组织，加入0.5mL 酸性提取液，冰浴研磨，煮沸5min(盖紧，以防止水分散失)，冰浴冷却后，10000g 4℃离心10min，取上清200μL，加入等体积碱性提取液混匀，10000g 4℃离心10min，取上清，冰上保存待测。 NADH 的提取：称取约0.1g 组织，加入0.5mL 碱性提取液，冰浴研磨，煮沸5min(盖紧，以防止水分散失)，冰浴冷却后，10000g 4℃离心10min，取上清200μL，加入等体积酸性提取液混匀，10000g 4℃离心10min，取上清，冰上保存待测。 3、细胞或细菌中NAD+和NADH 的提取： NAD+的提取：收集500 万细胞或细菌，加入0.5mL 酸性提取液，超声波破碎1min（强度20％或200W，超声2s，停1s），煮沸5min(盖紧，以防止水分散失)，冰浴中冷却后，10000g 4 ℃离心10min，取上清液200μL 至另一新的离心管中，加入等体积的碱性提取液使之中和，混匀，10000g 4℃离心10min，取上清，冰上保存待测。 NADH 的提取：收集500 万细胞或细菌，加入0.5mL 碱性提取液，超声波破碎1min（强度20％或200W，超声2s，停1s），煮沸5min(盖紧，以防止水分散失)，冰浴中冷却后，10000g 4 ℃离心10min，取上清液200μL 至另一新的离心管中，加入等体积的酸性提取液使之中和，混匀，10000g 4℃离心10min，取上清，冰上保存待测。 二、试剂准备 1、试剂R3：需要严格避光； 2、试剂R6：19.2 mL 乙醇和0.8 mL 蒸馏水混合，备用； 3、NAD 标准品：临用前加入1.5 mL 蒸馏水，即2 μmol/mL，将其稀释为1.25 nmol/mL 的NAD 标准溶液备用； 4、NADH 标准品：临用前加入1.4 mL 蒸馏水，即2 μmol/mL，将其稀释为1.25 nmol/mL 的NADH 标准溶液备用。 三、测定步骤 1、 可见分光光度计/酶标仪预热30min以上，调节波长至570nm，蒸馏水调零。 2、 操作表（在1.5mL棕色EP管中按下表依次加样）
混匀，取200μL 至微量玻璃比色皿或酶标板中， 570nm 下比色，读取吸光值ΔA=A 测定管-A 对照管，NAD标准管的记为ΔA 标准1=A 标准管1-A 空白管。NADH 标准管的记为ΔA 标准2=A 标准管2-A 空白管。（空白管只需做1-2 次） 四、NAD+含量的计算 1、血清（浆）中NAD+含量计算 NAD+含量(nmol/mL）=ΔA 测定÷（ΔA 标准1÷C 标）×V 提取÷V 血清 2、组织、细菌、细胞中NAD+含量计算 (1)按样本蛋白浓度计算 NAD+ (nmol/mg prot）=ΔA 测定÷（ΔA 标准1÷C 标）×V 提取÷(V 提取×Cpr) (2)按样本质量计算 NAD+ (nmol/g 质量）=ΔA 测定÷（ΔA 标准1÷C 标）×V 提取÷W (3)按细菌或细胞数量计算 NAD+ (nmol/104 cell）=ΔA 测定÷（ΔA 标准1÷C 标）×V 提取÷500 四、NADH 含量的计算 1、血清（浆）中NADH 含量计算 NADH 含量(nmol/mL）=ΔA 测定÷（ΔA 标准2÷C 标）×V 提取÷V 血清 2、组织中NADH 含量计算 (1) 按样本蛋白浓度计算 NADH (nmol/mg prot）=ΔA 测定÷（ΔA 标准2÷C 标）×V 提取÷(V 提取×Cpr) (2) 按样本质量计算 NADH (nmol/g 质量）=ΔA 测定÷（ΔA 标准2÷C 标）×V 提取÷W (3) 按细菌或细胞数量计算 NADH (nmol/104 cell）=ΔA 测定÷（ΔA 标准2÷C 标）×V 提取÷500 C 标：NAD或NADH标准溶液的浓度； Cpr：蛋白浓度，mg/mL； V提取：加入提取液总体积； V 血清：提取时加入的血清体积； W：样本质量，g； 500：细菌或细胞数量，500 万。 注意事项： 1、操作过程应避光。不可将试剂R1、R2、R3混合后再加，必须分开加。 2、反应过程要注意避光。 3、当吸光值大于1 时，建议稀释后测量。 本试剂盒仅供科研使用! |
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Copyright © 2022 上海惠诚生物科技有限公司
沪ICP备2021037845号-6
