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| Cat. Number | HK21224-48S |
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| Chemical Name | HK21224-48S 乙醇脱氢酶(ADH)测试盒(紫外分光光度法) |
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| Qty 1 |
50T/48S |
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| References | 乙醇脱氢酶ADH是生物体内短链醇代谢的关键酶，催化乙醇与乙醛可逆转换，在很多生理过程中起着重要作用。哺乳动物ADH主要在肝脏生成，肝脏损伤导致ADH释放到血清中。血清ADH活性高低反映了肝功能是否异常。 测定原理： ADH催化NADH还原乙醛生成乙醇和NAD+，NADH在340nm处有吸收峰，而NAD+没有；测定340nm 吸光度下降速率，来计算ADH活性。 需自备的仪器和用品： 冰、低温离心机、紫外分光光度计、微量石英比色皿/96孔板（UV板）、可调式移液器、研钵/匀浆器、蒸馏水。 产品组成：
实验步骤： 注意：实验之前建议选择2-3 个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。 一、样本处理（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献） 1、 组织：按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为1：5~10 的比例（建议称取约0.1g 组织，加入1mL 提取液）进行冰浴匀浆。16000g，4℃离心20min，取上清置冰上待测。 2、 细菌、细胞：按照细胞数量（104 个）：提取液体积（mL）为500~1000：1 的比例（建议500 万细胞加入1mL 提取液），冰浴超声波破碎细胞（功率300w，超声3 秒，间隔7 秒，总时间3min）；16000g，4℃离心20min，取上清液置冰上待测。 3、血清等液体：直接测定。 二、试剂准备 1、提取液：内含不溶物，使用前摇匀； 2、试剂R1：临用前把试剂R2转移到试剂R1中，分装保存于-20℃。 三、测定步骤 1、紫外分光光度计预热30min，调节波长到340nm，蒸馏水调零。 2、试剂R1在25℃水浴中保温30min以上。 3、空白管： 在1mL石英比色皿中依次加入100μL蒸馏水、800μL试剂一和100μL试剂三，迅速混匀后于340nm测定吸光值变化，分别记录15s和75s时吸光值，分别记为A1和A2。ΔA空白管=A1-A2。（空白管只需做1~2个） 4、测定管： 在1mL石英比色皿中依次加入100μL上清液、800μL试剂一和100μL试剂三，迅速混匀后于340nm测定吸光值变化，分别记录15s和75s时吸光值，分别记为A3和A4。ΔA测定管=A3-A4。 三、ADH活性计算 a.使用微量石英比色皿测定的计算公式如下 （1）按蛋白浓度计算 活性单位定义：25℃中每毫克蛋白每分钟氧化1μmol NADH为1个酶活单位。 ADH (U/mg prot) =[(ΔA测定管–ΔA空白管)÷ε÷d×V反总×106]÷(Cpr×V样)÷T （2）按样本质量计算 活性单位定义：25℃中每克组织每分钟氧化1μmol NADH为1个酶活单位。 ADH (U/g 质量) =[(ΔA测定管–ΔA空白管)÷ε÷d×V反总×106] ÷(W×V样÷V样总)÷T （3）按细胞数量计算 活性单位定义：25℃中每104个细胞每分钟氧化1μmol NADH为1个酶活单位。 ADH (U /104 cell) = [(ΔA测定管–ΔA空白管)÷ε÷d×V反总×106]÷(细胞数量×V样÷V样总)÷T （4）按液体体积计算 活性单位定义：25℃中每毫升样本每分钟氧化1μmol NADH为1个酶活单位。 ADH (U/mL) = [(ΔA测定管–ΔA空白管)÷ε÷d×V反总×106]÷V样÷T ε：NADH摩尔消光系数，6.22×103L/mol/cm； d：比色皿光径，1cm； V反总：反应体系总体积； 106：单位换算系数，1mol=1×106μmol； Cpr：上清液蛋白质浓度，mg/mL； W：样本质量，g； V样：加入反应体系中上清液体积； V样总：提取液体积，1mL； T：反应时间，1min； 细胞数量：以万计。 b.使用96孔板测定的计算公式如下 （1）按蛋白浓度计算 活性单位定义：25℃中每毫克蛋白每分钟氧化1μmol NADH为1个酶活单位。 ADH (U/mg prot) =[(ΔA测定管–ΔA空白管)÷ε÷d×V反总×106]÷(Cpr×V样)÷T （2）按样本质量计算 活性单位定义：25℃中每克组织每分钟氧化1μmol NADH为1个酶活单位。 ADH (U/g 质量) =[(ΔA测定管–ΔA空白管)÷ε÷d×V反总×106]÷(W×V样÷V样总)÷T （3）按细胞数量计算 活性单位定义：25℃中每104个细胞每分钟氧化1μmol NADH为1个酶活单位。 ADH (U/104 cell) = [(ΔA测定管–ΔA空白管)÷ε÷d×V反总×106]÷(细胞数量×V样÷V样总)÷T （4）按液体体积计算 活性单位定义：25℃中每毫升样本每分钟氧化1μmol NADH为1个酶活单位。 ADH (U/mL) = [(ΔA测定管–ΔA空白管)÷ε÷d×V反总×106]÷V样÷T ε：NADH摩尔消光系数，6.22×103L/mol/cm； d：96孔板光径，0.6cm； V反总：反应体系总体积； 106：单位换算系数，1mol=1×106μmol； Cpr：上清液蛋白质浓度，mg/mL； W：样本质量，g； V样：加入反应体系中上清液体积； V样总：提取液体积； T：反应时间，1min； 细胞数量：以万计。 注意事项： 上清液蛋白质浓度需要另外测定。 本试剂盒仅供科研使用! |
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