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| Cat. Number | HK21216-48S |
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| Chemical Name | HK21216-48S 丙酮酸脱羧酶(PDC)测试盒(紫外分光光度法)/Pyruvate Decarboxylase (PDC) Assay Kit |
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| Qty 1 |
50T/48S |
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| References | 丙酮酸脱羧酶PDC主要存在于酵母中，是乙醇发酵的关键酶之一，催化丙酮酸脱羧生成乙醛。 测定原理： PDC催化丙酮酸脱羧生成乙醛，添加乙醇脱氢酶（ADH）来进一步催化 NADH还原乙醛生成乙醇和NAD+；NADH在340 nm有吸收峰，而NAD+没有；通过测定340 nm光吸收下降速率，来计算PDC活性。 需自备的仪器和用品： 台式离心机、紫外分光光度计/酶标仪、水浴锅、微量石英比色皿/ 96孔UV板、可调式移液枪、研钵/匀浆器、冰和蒸馏水。 产品组成：
实验步骤： 注意：实验之前建议选择2-3 个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。 一、样本处理（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献） 1、细胞或细菌样本的制备：先收集细胞或细菌样本到离心管内，弃上清，按照每500 万细胞或细菌加入1mL提取液，超声波破碎细菌或细胞（功率20%，超声3s，间隔10s，重复30 次）。16000g，4℃离心20min，取上清，置冰上待测。 2、组织样本：称取约0.1g 组织，加入1mL 提取液，冰上充分研磨。16000g，4℃离心20min，取上清，置冰上待测。 3、血清（浆）样本：直接检测。 二、试剂准备 1、提取液：内含不溶物，使用前摇匀； 2、试剂R的配制：临用前配制，将试剂R1B、试剂R1C 加入到试剂一A 中并充分溶解。-20℃分装保存，可保存1 个月。 3、试剂R2B：临用前加入0.6mL 蒸馏水溶解，用不完的试剂-20℃分装保存两周。 4、试剂R2C：临用前加入1mL 蒸馏水溶解，用不完的试剂-20℃分装保存两周。 5、试剂R2的配制：临用前配制，取2.625mL 试剂R2A、0.225mL 试剂R2B、0.15mL 试剂R2C 混合（共3mL，约30T），现用现配。 三、操作步骤 1、紫外分光光度计/酶标仪预热30min以上，调节波长至340nm，蒸馏水调零。 2、根据样本数取适量试剂R1、试剂R3 37℃（哺乳动物）或25℃（其他物种）水浴提前预热30min。 3、操作表：
迅速混匀后于340nm 比色，记录10s 和70s 的吸光值，测定管的记为A1 和A2，空白管的记为A3 和A4，计算ΔA=（A1-A2）-（A3-A4）。（空白管只需做1-2 次） 四、PDC活性计算 A.使用微量石英比色皿测定的计算： 1、血清（浆）PDC活力的计算： 单位的定义：37℃（哺乳动物）或25℃（其他物种）中，每毫升血清（浆）在反应体系中每分钟催化1μmol NADH氧化定义为一个酶活力单位。 PDC（U/mL）=ΔA×V反总÷(ε×d)×106÷V样本÷T 2、 组织中PDC活力的计算： （1）按样本蛋白浓度计算： 单位的定义：37℃（哺乳动物）或25℃（其他物种）中，每mg组织蛋白在反应体系中每分钟催化1μmol NADH氧化定义为一个酶活力单位。 PDC（U/mg prot）=ΔA×V反总÷(ε×d)×106÷(V样本×Cpr)÷T （2）按样本质量计算： 单位的定义：37℃（哺乳动物）或25℃（其他物种）中，每g组织质量在反应体系中每分钟催化1μmol NADH氧化定义为一个酶活力单位。 PDC（U/g 质量）=ΔA×V反总÷(ε×d)×106÷ (W÷V提取×V样本)÷T 3、细菌或细胞中PDC活力的计算： 按细菌或细胞数量计算： 单位的定义：37℃（哺乳动物）或25℃（其他物种）中，每1万个细菌或细胞在反应体系中每分钟催化1μmol 的NADH氧化定义为一个酶活力单位。 PDC（U/104 Cell）= ΔA×V反总÷(ε×d)×106÷(V样本÷V提取×500)÷T ε：NADH摩尔消光系数，6.22×103L/mol/cm； d：比色皿光径，1cm； V反总：反应体系总体积; V样本：加入反应体系中上清液体积； Cpr：蛋白浓度（mg/mL），需要另外测定； T：反应时间，1min； W：样本质量，g； V提取：提取液体积； 500：细菌或细胞总数，500万； 106：单位换算系数，1mol=106μmol。 B.使用96孔UV板测定的计算： 将上述公式中的d-1cm（比色皿光径）换为d-0.6cm（96孔板光径）进行计算即可。 注意事项： 1、实验时，试剂二和样本在冰上放置，以免变性和失活。 2、比色皿中反应液的温度必须保持37℃或25℃，取小烧杯一只装入一定量的37℃或25℃蒸馏水，将此烧杯放入37℃或25℃水浴锅中。在反应过程中把比色皿连同反应液放在此烧杯中。 3、最好两个人同时做此实验，一个人比色，一个人计时，以保证实验结果的准确性。使用96 孔板测定时不推荐同时测多个样本。 4、如果1 分钟变化值较小可延长反应时间，同时注意修改计算公式。 本试剂盒仅供科研使用! |
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