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| Cat. Number | HK21215-96S |
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| Chemical Name | HK21215-96S 丙酮酸脱氢酶(PDH)测试盒(酶标板法) |
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| Qty 1 |
100T/96S |
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| References | 丙酮酸脱氢酶PDH（EC 4.1.1.1）广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中，是丙酮酸脱氢酶复合体(PDHC)催化丙酮酸氧化脱羧的限速酶，催化丙酮酸脱梭生成羟乙基-TPP，把糖酵解和三羧酸循环连接起来。 测定原理： PDH催化丙酮酸脱氢，同时还原2.6-二氯酚靛酚（2,6-DCPIP)，从而导致605nm光吸收的减少。 需自备的仪器和用品: 可见分光光度计/酶标仪、水浴锅、台式离心机、可调式移液器、微量玻璃比色皿/96孔板、研钵/匀浆器、冰和蒸馏水。 产品组成：
实验步骤: 注意：实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。 一、样本处理（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献) 1.组织：称取约0.1g 组织，加入1mL试剂R1和10uL试剂R2，用冰浴匀浆器或研钵匀浆充分研磨，4℃ 11000g离心10min，取上清，置冰上待测。 2.细胞或者细菌样本：先收集500万细胞或细菌到离心管内，离心后弃上清；之后加入1mL试剂R1和10uL试剂R2，冰浴超声波破碎细菌(功率200W，超声3s，间隔7s，总时间5min)；然后11000g, 4℃，离心10 min，取上清置于冰上待测。 3.血清(浆)及其它液体样本：直接检测。若溶液有浑浊则离心后去上清进行测定。 二、试剂准备 1.试剂R2：为易挥发试剂，用完后尽快密封，-20℃保存。 2.工作液的配制：临用前把5.75mL试剂R4、一支试剂R5、0.45mL试剂R6、1.75mL试剂R7转移到一瓶试剂R3中混合溶解待用(共15.45mL，约85T)；用不完的试剂-20℃分装保存，可保存4周。避免反复冻融。 三、测定步骤 1、可见分光光度计或酶标仪预热30min以上，调节波长至605nm，分光光度计蒸馏水调零。 2、每个样本需要180uL工作液，根据实验所需取出一定量的工作液置于37°C (哺乳动物)或25°C (其它物种)水浴锅中水浴10min。 3、操作表：在微量比色皿或96孔板中加入：
四、PDH活性计算 a.用微量比色皿测定的计算公式如下 1.按样本蛋白浓度计算 单位的定义：每mg组织蛋白在反应体系中每分钟消耗1nmo1 2,6-二氯酚靛酚定义为一个酶活性单位。 PDH活性（U/mg prot）=[(ΔA测定-ΔA空白)÷(εxd)×V反总×109]÷(Cpr×V样)÷T 2.按样本质量计算 单位的定义：每g组织在反应体系中每分钟消耗1nmol 2,6-二氯酚靛酚定义为一个酶活性单位。 PDH活性（U/g质量）=[(ΔA测定-ΔA空白)÷(εxd)×V反总×109]÷(V样÷V样总×W)÷T 3.按细菌或细胞数量计算 单位的定义：每1万个细菌或细胞在反应体系中每分钟消耗1nmol 2,6-二氯酚靛酚定义为一个酶活性单位。 PDH活性（U/104 cell）=[(ΔA测定-ΔA空白)×V反总÷(εxd)×109]÷(V样÷V样总×500)÷T 4.按样本体积计算 单位的定义：每mL液体在反应体系中每分钟消耗1nmo1 2,6-二氯酚靛酚定义为一个酶活性单位。 PDH活性(U/mL）=[(ΔA测定-ΔA空白)×V反总÷(εxd)×109]÷V样÷T V反总：反应体系总体积; ε: 2,6-二氯吲哚酚摩尔消光系数，2.1×104L/mol/cm; d：比色皿光径，1cm; V样：加入样本体积; V样总：加入试剂R1和试剂R2体积; T：反应时间，1min; Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL; W：样本质量，g: 500：细菌或细胞总数，500万。 b.用96孔板测定的计算公式如下 1．按样本蛋白浓度计算 单位的定义：每mg组织蛋白在反应体系中每分钟消耗1nmo1 2,6-二氯酚靛酚定义为一个酶活性单位。 PDH活性（U/mg prot）=[(ΔA测定-ΔA空白)xV反总÷(εxd）×109]÷(Cpr×V样)÷T 2．按样本质量计算 单位的定义：每g组织在反应体系中每分钟消耗1nmo1 2,6-二氯酚靛酚定义为一个酶活性单位。 PDH活性（U/g 质量）=[(ΔA测定-ΔA空白)xV反总÷(εxd）x109]÷(V样÷V样总×W)÷T 3．按细菌或细胞数量计算 单位的定义：每1万个细菌或细胞在反应体系中每分钟消耗1nmol 2,6-二氯酚靛酚定义为一个酶活性单位。 PDH活性（U/104cell)=[(ΔA测定-ΔA空白)×V反总÷(εxd）x109]÷(V样÷V样总×500)÷T 4．按样本体积计算 单位的定义：每mL液体在反应体系中每分钟消耗1nmo1 2,6-二氯酚靛酚定义为一个酶活性单位。 PDH活性（U/mL)=[(ΔA测定-ΔA空白)×V反总÷(ε×d)×109]÷V样÷T V反总：反应体系总体积; ε：2,6-二氯吲哚酚摩尔消光系数，2.1×104 L/mol/cm; d: 96孔板光径，0.5cm； V样：加入样本体积； V样总：加入试剂R1和试剂R2体积； T：反应时间，1min； Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL； W：样本质量，g； 500：细菌或细胞总数，500万。 注意事项: 1、测定过程中所有样本在冰上放置并于2小时内检测，以兔变性和失活。 2、测定管的AA值在0.01-0.25之间,若测定管的AA值大于0.25,需将样本进行稀释。计算公式中乘以稀释倍数。若测定管的△A值小于0.01，需加大样本量后重新测定，注意同步修改计算公式。 3、由于试剂一中含有一定浓度的蛋白（约1mg/mL)，所以在测定样品蛋白浓度时需要减去试剂一的蛋白含量。 本试剂盒仅供科研使用! |
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