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| Cat. Number | HK21213-96S |
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| Chemical Name | HK21213-96S 丙酮酸羧化酶(PC)测试盒(酶标板法)/Pyruvate Carboxylase Assay Kit |
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| Qty 1 |
100T/96S |
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| References | 丙酮酸羧化酶(pyruvate carboxylase，PC，EC 6.4.1.1)广泛存在于动物、霉菌和酵母的线粒体中，但在植物体和大部分细菌中却不含此酶。是供给草酰乙酸的主要补充反应，是糖异生过程的第一个限速酶。 测定原理： PC催化丙酮酸、ATP、CO2和水生成草酰乙酸、ADP和Pi，苹果酸脱氢酶进一步催化草酰乙酸和NADH生成苹果酸和NAD+，在340nm下测定NADH氧化速率，即可反映PC活性。 需自备的仪器用品： 紫外分光光度计/酶标仪、台式离心机、水浴锅、微量石英比色皿/96孔UV板、可调式移液枪、研钵/匀浆器、冰和蒸馏水。 产品组成：
实验步骤： 注意：实验之前建议选择2-3 个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。 一、样本处理（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献） 1、取约0.1g 组织或收集500 万细胞，加入1.0 mL 提取液，用冰浴匀浆器或研钵匀浆。 2、4℃1000g 离心10min。将上清液移至另一离心管中，4℃11000g 离心15min。 3、上清液即胞浆提取物，可用于测定从线粒体泄漏的PC（此步可选做，可以判断线粒体提取效果）。 4、在沉淀中加入1mL 提取液，超声波破碎（功率20%，超声5 秒，间隔10 秒，重复12 次），用于PC 活性测定，并且用于蛋白含量测定。 二、试剂准备 1、试剂R3：临用前加入3 mL 蒸馏水溶解；可分装后-20℃保存，避免反复冻融； 2、试剂R4：临用前加入2 mL 蒸馏水溶解；可分装后-20℃保存，避免反复冻融； 3、试剂R6：液体置于试剂瓶内EP 管中。临用前按试剂R6：试剂R6稀释液=1:428（V:V）的比例稀释试剂R6备用，现用现配； 4、工作液的配制：按照试剂R2：试剂R3：试剂R4=2:1:1 的体积比例充分混匀，现用现配。 三、测定步骤 1、分光光度计/酶标仪预热30min以上，调节波长至340nm，蒸馏水调零。 2、试剂R1用前37℃孵育15min。 3、操作表：
四、PC酶活计算 1. 按微量石英比色皿计算： 单位的定义：每毫克蛋白每分钟消耗1 nmol 的NADH定义为一个酶活力单位。 PC酶活（U/mg prot）= ΔA÷（ε×d）×109×V反总÷（V样×Cpr）÷T ε：NADH摩尔消光系数，6.22×103 L/mol/cm； d：比色皿光径，1cm； V反总：反应体系总体积； V样：反应体系中样本体积； Cpr：样本蛋白浓度，mg/mL； T：反应时间：2min。 2. 按96孔UV板计算： 将上述计算公式中的d-1cm改为d-0.6cm进行计算即可。 注意事项： 1. 为保证实验结果的准确性，需先取1-2 个样做预实验，ΔA 大于0.8 时（96 孔UV 板测定时ΔA 大于0.5 时），建议将粗酶液用提取液稀释后再进行测定。当ΔA 小于0.01 时，可以延长反应时间（5min 或10min）来测定。 2. 空白管为检测各试剂组分质量的检测孔，正常情况下，变化不超过0.05。 3. 样本的蛋白浓度需自行测定，由于提取液中含有较高的蛋白浓度（约1mg/mL），所以测定样本蛋白浓度时需扣除提取液自身蛋白浓度。 4. 推荐使用样本蛋白浓度计算酶活，若用样本质量计算，则需加测胞浆提取物酶活，上清和沉淀酶活之和方为总酶活。 5. 本试剂盒试剂足够完成100 管反应。 6. 附:使用样本重量计算公式：（样本检测数为100T/48S） （1）按微量石英比色皿计算： A、上清中PC 活力的计算: 按样本质量计算： 酶活定义：每克样本每分钟消耗1 nmol 的NADH 定义为一个酶活力单位。 PC 酶活（U/g 质量）=ΔA1÷（ε×d）×109×V 反总÷（V 样×W÷V 样总）÷T ΔA1：上清测定值； ε：NADH 摩尔消光系数，6.22×103 L/mol/cm； d：比色皿光径，1cm； V 反总：反应体系总体积； V 样：反应体系中样本体积； V 提取：加入的提取液体积； T：反应时间：2min； W：样本质量，g。 B、沉淀中PC 活力的计算: 按样本质量计算： 酶活定义：每克样本每分钟消耗1 nmol 的NADH 定义为一个酶活力单位。 PC 酶活（U/g 质量）=ΔA2÷（ε×d）×109×V 反总÷（V 样×W÷V 样总）÷T ΔA2：上清测定值； ε：NADH 摩尔消光系数，6.22×103 L/mol/cm； d：比色皿光径，1cm； V 反总：反应体系总体积； V 样：反应体系中样本体积； V 提取：沉淀重悬体积； T：反应时间：2min； W：样本质量，g。 C、样本PC 总活力的计算: 样本PC 总活力即为上清中PC 活力与沉淀中PC 活力之和。 按样本质量计算： PC（U/g 质量）=1607×ΔA1÷W+1607×ΔA2÷W。 （2）按96 孔UV 板计算： 将上述计算公式中的d-1cm 改为d-0.6cm 进行计算即可。 本试剂盒仅供科研使用! |
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