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| Cat. Number | HK21210-48S |
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| Chemical Name | HK21210-48S 丙酮酸激酶(PK)测试盒(可见分光光度法) |
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| Qty 1 |
50T/48S |
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| References | 丙酮酸激酶PK（EC 2.7.1.40）广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中，催化糖酵解过程中的最后一步反应，是糖酵解过程中的主要限速酶之一，也是产生ATP的关键酶之一，因此测定PK活性具有重要意义。
PK催化磷酸烯醇式丙酮酸和ADP生成ATP和丙酮酸，乳酸脱氢酶进一步催化NADH和丙酮酸生成乳酸和NAD+，在340nm下测定NADH下降速率，即可反映PK活性。 需自备的仪器和用品: 紫外分光光度计、台式离心机、水浴锅/恒温培养箱、可调式移液器、1mL石英比色皿、研钵/匀浆器/细胞超声破碎仪、冰和蒸馏水。 产品组成：
实验步骤: 注意:实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。 一、样本处理（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献） 1. 细菌或培养细胞：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照细菌或细胞数量（10°个)：提取液体积(mL)为500-1000: 1的比例(建议500万细菌或细胞加入lmL提取液)，超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率200W，超声3s，间隔10s，重复30次);8000g 4C离心10min，取上清，置冰上待测。 2 组织：按照组织质量（g)：提取液体积(mL）为1:5-10的比例（建议称取约0.1g组织，加入lmL提取液)，进行冰浴匀浆；8000g 4C离心10min，取上清，置冰上待测。 3.血清（浆）等其他液体：直接检测。若有沉淀请离心后取上清待测。 二、试剂准备 1、试剂R2A：临用前加入1.2mL蒸馏水，用不完的试剂可-20°C分装保存4周，避免反复冻融; 2、试剂R2B：临用前取1支加入0.7mL蒸馏水，用不完的试剂可-20°C分装保存4周，避免反复冻融； 3、试剂R3：临用前加入1.8mL蒸馏水，用不完的试剂可-20°C分装保存4周，避免反复冻融； 4、试剂四：临用前根据用量按照试剂四:蒸馏水=5uL:100uL(7T）的体积比例充分混匀，冰上放置备用，现用现配; 5、工作液的配制：按试剂R1:试剂R2A:试剂R2B=860uL: 20uL: 20uL (1T)的比例配制，现用现配。 三、测定步骤 1、紫外分光光度计预热30min以上，调节波长至340nm，蒸馏水调零。 2、工作液临用前于37℃(哺乳动物）或25℃(其他物种）预热10min。 3、加样表：
将上述试剂按顺序加入1mL石英比色皿中，立即充分混匀后于340nm处测定20s时的吸光值A迅速置于37℃（哺乳动物）或25℃(其它物种）准确反应10min(酶标仪有控温功能可将温度调至37℃)，拿出迅速擦干测定10min20s时的吸光值A2。计算ΔA=A1-A2。 四、PK活性计算 1、按液体体积计算 单位的定义：每毫升液体每分钟消耗1nmol NADH定义为一个酶活力单位。 PK活性(U/mL） =[ΔA×V反总÷(ε×d) ×109]÷V样÷T 2、按样本蛋白浓度计算 单位的定义：每mg 组织蛋白每分钟消耗1nmol NADH定义为一个酶活力单位。 PK活性（U/mg prot）=[ΔA×V反总÷(εxd)×109]÷(Cpr×V样)÷T 3、按样本质量计算 单位的定义：每g 组织每分钟消耗1nmol NADH定义为一个酶活力单位。 PK活性（U/g质量）=[ΔA×V反总÷(ε×d)×109]÷(WxV样÷V样总)÷T 4、按细菌或细胞数量计算 单位的定义：每1万个细菌或细胞在反应体系中每分钟消耗1nmol NADH定义为一个酶活力单位。 PK活性（U/104cell)=[ΔA×V反总÷(εxd)×109]÷(500×V样÷V样总)÷T V反总：反应体系总体积； ε：NADH摩尔消光系数，6.22×103L/molcm; d：比色皿光径，1 cm; V样：加入样本体积; V样总：加入提取液体积; T：反应时间，2min; Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL; W：样本质量，g; 500：细菌或细胞总数，500万。 注意事项： 1．测定过程中试剂R3、样本在冰上放置，以免变性和失活。 2．比色皿中反应液的温度尽量保持37℃（哺乳动物）或25℃（其它物种），取小烧杯一只装入一定量的37℃或25℃蒸馏水，将此烧杯放入37℃或25℃水浴锅中。在反应过程中把比色皿连同反应液放在此烧杯中。或酶标板放入37℃或25℃恒温培养箱中孵育。 3．最好两个人同时做此实验，一个人比色，一个人计时，以保证实验结果的准确性。 本试剂盒仅供科研使用! |
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