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Cat. Number

HK21207-96S

Chemical Name

HK21207-96S 丙二醛(MDA)试剂盒(酶标板法)/Malondialdehyde (MDA) Assay Kit

Qty 1

100T/96S

References

氧自由基作用于脂质的不饱和脂肪酸，生成过氧化脂质；后者逐渐分解为一系列复杂的化合物，其中包括MDA。通过检测MDA的水平即可检测脂质氧化的水平。

测定原理：

MDA与硫代巴比妥酸(thiobarbituric acid，TBA)缩合，生成红色产物，在532nm有最大吸收峰，进行比色后可估测样品中过氧化脂质的含量；同时测定600nm下的吸光度，利用532nm与600nm下的吸光度的差值计算MDA的含量。

需要的仪器，耗材:

可见分光光度计/酶标仪、水浴锅、台式离心机、可调式移液器、微量玻璃比色皿/96孔板、研钵/匀浆器、冰和蒸馏水。

产品组成：

试剂名称	规格	保存条件
提取液	液体×1 瓶	2-8℃
试剂R1	液体×1 瓶	2-8℃
试剂R2	液体×1 瓶	2-8℃
试剂R3	液体×1 瓶	2-8℃
试剂R4	液体×1 瓶	2-8℃
试剂R5	粉剂×1 瓶	常温保存

实验步骤：

注意：实验之前建议选择2-3 个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。

一、样本处理（具体比例可以参考文献）

1、细菌或细胞样本的制备：收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照每500万细菌或细胞加入1mL提取液，超声波破碎细菌或细胞（功率200W，超声3s，间隔10s，重复30次）；8000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。

2、组织样本的制备：称取约0.1g组织，加入1mL提取液进行冰浴匀浆；8000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。

3、低、中脂血血清（浆）等液体样本：直接检测。

4、高脂血或者油脂类样本：取40μL样本和80μL无水乙醇混合（即样本被稀释3倍），涡旋震荡5min后使用。不同高脂肪类样本可能会有不同的稀释倍数，可以稀释不同倍数进行预实验以确定最佳稀释倍数。同时操作表中空白管的蒸馏水应以（33uL蒸馏水+67uL乙醇）代替。

二、试剂准备

MDA检测工作液的配制：临用前取1瓶试剂R2加入20mL试剂一，溶解混匀，2-8℃保存一个月。MDA检测工作液较难溶解，可以70℃加热，并剧烈振荡以促进溶解，或者通过超声处理以促进溶解。

三、测定步骤

1、可见分光光度计/酶标仪预热30min 以上，蒸馏水调零。

2、按下表步骤加样:

试剂名称（uL）	测定管	空白管
MDA检测工作液	300	300
蒸馏水	-	100
样本	100	-
试剂R3	100	100

混合液在100℃水浴中保温60min后(盖紧，防止水分散失)，置于冰浴中冷却，10000g，常温，离心10min吸取200uL 上清液于微量玻璃比色皿或96 孔板中，测定各样本在532nm和 600nm处的吸光度。分别计算△A532=A532测定-A532空白，△A600=A600 测定-A600空白，△A=△A532-△A600(空白管只需做1-2次)。

注意：高脂血或者油脂类样本在操作表中空白管的蒸馏水应以（33L蒸馏水+67]uL乙醇〉代替

四、MDA含量计算

A、按微量比色皿计算

(1）按照蛋白浓度计算

MDA含量(nmolmg prot）=[AA×V反总÷(ε×d)×109]-(Cpr×V样本)×F

(2）按照样本质量计算

MDA含量(nmolg质量)=[AA×V反总÷(εxd)×109]+(W×V样本÷V提取)xF

(3）按照细菌或细胞数量计算

MDA含量(nmol10 cell)=[AA×V反总÷(εxd)×109]÷(500×V样本-V提取)×F

(4）按照血清（浆）体积计算

MDA含量(nmolmL)=[AA×V反总÷(ε×d)×109]÷V样本×F

V反总:反应体系总体积;