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| Cat. Number | HK21203-48S |
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| Chemical Name | HK21203-48S 苯胺-4羟化酶(AH)测试盒(酶标板法) |
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| Qty 1 |
100T/48S |
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| References | 细胞色素P450酶是一组主要存在与肝脏的同工酶，在外源物质代谢众具有重要作用，尤其是药物和毒物的代谢。AH在P450酶系中相当于CYP2E1亚型，CYP2E1不仅参与了药物的代谢，而且还能催化多种前致癌物和前读物的活化过程。 测定原理： AH催化苯胺化后产生的4-氨基酚，进一步转变为酚-吲哚复合物，在630nm处有特征吸收峰；通过测定630nm吸光度增加速率，来计算AH活性。 需自备的仪器和用品： 可见分光光度计/酶标仪、低温离心机、超速离心机、水浴锅/恒温培养箱、研钵/匀浆器、可调式移液器、微量玻璃比色皿/96 孔板、冰和蒸馏水。 产品组成：
实验步骤： 注意：实验之前建议选择2-3 个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。 一、粗酶液提取（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献） 1、除去细胞核和线粒体等：称约0.5g 组织，加入4℃预冷的1mL 试剂R1，冰上充分研磨，10 000g，4℃离心30min，取上清液，转移到超速离心管中。 2、粗制微粒体：4℃，100 000g，离心60min，弃上清液。 3、除血红蛋白等杂质：向步骤2 的沉淀中加1mL 试剂R1，盖紧后充分震荡溶解，100 000g 离心30min，弃上清液。 4、最终微粒体：向步骤3 的沉淀中加0.5mL 试剂R2，盖紧后充分震荡溶解，即粗酶液，置于冰上待测。 二、试剂准备 1、试剂R1：临用前取一瓶加入60mL 蒸馏水，充分溶解；用不完的试剂4℃保存可保存4 周； 2、试剂R3：临用前取一瓶加入6mL 蒸馏水，充分溶解；用不完的试剂-20℃分装保存2 周，避免反复冻融； 3、试剂R4：临用前加入3mL 蒸馏水，充分溶解；用不完的试剂4℃可保存4 周； 4、试剂R6：临用前取一瓶加入6mL 蒸馏水，充分溶解；用不完的试剂4℃密封保存可保存4 周。 三、测定步骤 1、分光光度计或酶标仪预热30min 以上，调节波长至630nm，蒸馏水调零。 2、临用前根据实验用量取出部分试剂R2在37℃水浴中预热30min。 3、试剂五置于冰浴冷却30min。 4、在EP 管加入下列试剂：
注：标准管只需测1-2 次。每个测定管都需设一个对照管。 四、AH 活性计算 （1）按蛋白浓度计算 活性单位定义：37℃条件下，每毫克蛋白每分钟催化产生1nmol 4-氨基酚为1 个酶活单位。 AH 活性(nmol/min/mg prot) = C 标× V 标×（A 测定管-A 对照管）÷A 标准管×F÷（Cpr×V 样）÷T （2）按样本质量计算 活性单位定义：37℃条件下，每克组织每分钟催化产生1nmol 4-氨基酚为1 个酶活单位。 AH 活性(nmol/min/g 质量) = C 标×V 标×（A 测定管－A 对照管）÷A 标准管×F÷(V 样×W)÷T C 标：标准溶液浓度； V 标：标准溶液体积； F：稀释倍数，V 反总÷V 上清液=300μL÷100μL=3； Cpr：粗酶液蛋 白质浓度（mg/mL），需要另外测定，建议使用本公司BCA 蛋白质含量测定试剂盒； V 样：加入粗酶液体积； W：样本质量，g； T：催化反应时间，30min。 注意事项： 1、如果测定吸光值A＞1.5 或ΔA＞1，建议稀释样本后再测定，计算公式中乘以稀释倍数。 2、如果测定吸光值较低或接近空白OD 值，建议增加样本量后再进行测定，注意同步修改计算公式。 3、粗酶液提取后需在当日完成测定。 本试剂盒仅供科研使用! |
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