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Cat. Number

HK21190-48S

Chemical Name

HK21190-48S γ-谷氨酰半胱氨酸连接酶(GCL)测试盒(可见分光光度法)

Qty 1

50T/48S

References

γ-谷氨酰半胱氨酸连接酶(GCL)是 GSH 合成的限速酶，GSH 对 GCL 有反馈抑制作用。GCL基因表达受多种因素调节，如氧化剂、抗氧化剂、生长因子和炎症因子等。GCL活性高低对GSH含量和GSH/GSSG比值有重要影响。

测定原理：

在ATP和Mg2+存在下，GCL催化谷氨酸和半胱氨酸合成γ-谷氨酰半胱氨酸；同时ATP去磷酸化产生无机磷分子，通过测定无机磷增加速率，即可计算出GCL活性。

需自备的仪器和用品：

冷冻离心机、水浴锅、移液器、可见分光光度计/酶标仪、微量玻璃比色皿/96孔板、研钵/匀浆器、浓硫酸和蒸馏水。

产品组成：

实验步骤：

一、样本处理（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献）

注意：实验之前建议选择2-3 个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。

1. 组织：按照组织质量（g）：试剂R1体积（mL）为1：5~10 的比例（建议称取约0.1g 组织，加入1mL 试剂R1）进行冰浴匀浆。8000g，4℃离心10min，取上清，置冰上待测。

2. 细菌、细胞：按照细胞数量（10⁴ 个）：试剂R1体积（mL）为500~1000：1 的比例（建议500 万细胞加入1mL试剂R1），冰浴超声波破碎细胞（功率300w，超声3 秒，间隔7 秒，总时间3min）；然后8000g，4℃，离心10min，取上清置于冰上待测。

3. 血清等液体：直接测定。

二、试剂准备

1、试剂R2：临用前加14 mL 蒸馏水充分震荡溶解，用不完的试剂-20℃分装保存，禁止反复冻融；

2、试剂R3：临用前加3.5 mL 蒸馏水充分震荡溶解；

3、试剂R5：临用前加入30mL 蒸馏水，充分震荡溶解后，缓缓加入1000 μL 浓硫酸（自备），边加边搅拌；

4、标准品：1 μmol/mL磷标准溶液。临用前将标准液用蒸馏水稀释成0.1 μmol/mL磷标准溶液。

三、测定步骤

1、分光光度计或酶标仪预热30min，调节波长到660nm，蒸馏水调零。

2、加样表：

试剂名称(uL)	对照管	测定管	标准管	空白管
试剂R1	240	240	-	-
试剂R2	260	260	-	-
试剂R3	60	60	-	-
样本	-	120	-	-
混匀后盖紧，37℃水浴准确反应15min；			-	-
试剂R4	300	300	-	-
样本	120	-	-	-
混匀后，室温（25℃左右）10000rpm，离心10 min；
上清	500	500	-	-
磷标准品	-	-	500	-
蒸馏水	-	-	-	500
试剂R5	500	500	500	500
混匀后盖紧，45℃水浴10min，冷却后测定660nm 处光吸收，尽快测完。计算ΔA 测=A 测定管-A 对照管，ΔA 标=A 标准管-A 空白管。