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| Cat. Number | HK21183-48S |
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| Chemical Name | HK21183-48S β-淀粉酶测试盒(酶标板法) |
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| Qty 1 |
100T/48S |
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| References | 淀粉酶负责水解淀粉，主要包括α-淀粉酶和 β-淀粉酶。β-淀粉酶(EC 3.2.1.2)可随机地作用于淀粉中的 α-1,4-糖苷键，生成葡萄糖、麦芽糖、麦芽三糖、糊精等还原糖。 还原糖还原 3,5-二硝基水杨酸生成棕红色物质。α-淀粉酶不耐酸，β-淀粉酶不耐热。根据上述特性，钝化其中之一，就可测出另一种淀粉酶的活力。 需自备的仪器和用品︰ 可见分光光度计/酶标仪、水浴锅、离心机、可调式移液器、96孔板/微量玻璃比色皿、研钵/匀浆器和蒸馏水。 产品组成：
实验步骤: 一、样本处理（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献) 称取约0.1g样本，加入0.8mL蒸馏水，研磨匀浆；将匀浆倒入离心管中，提取液在室温下放置提取15min，每5min振荡1次，使其充分提取；6000g，常温离心10min，取上清液加蒸馏水定容至10mL，摇匀，即淀粉酶原液。 吸取上述淀粉酶原液1mL，加入4mL蒸馏水，摇匀，即为淀粉酶稀释液，用于(a+β）淀粉酶总活力的测定。 二、试剂准备 1、试剂R1：若有黄色晶体析出，需加热溶解后再用; 2、试剂R2：临用前取取1支试剂R3加入到1瓶试剂R2中，置于常温水中并加热至煮沸，期间不断搅拌粉剂至溶解，用不完的试剂2-8℃保存4周; 3、标准品：10 mg 无水葡萄糖。临用前加入1mL蒸馏水配制成10 mg/mL的标准溶液，2-8°℃保存两周 三、测定步骤 1.可见分光光度计/酶标仪预热30min以上，调节波长到540nm，分光光度计蒸馏水调零。 2.标准液的稀释：将10mg/mL葡萄糖标准液用蒸馏水稀释为0.5、0.25、0.125、0.0625、0.03125、0.015625、0.0078mg/mL的标准溶液。备注：实验中每个标准管需75uL标准溶液。 3.取2支EP管分别加入75uL淀粉酶原液和淀粉酶稀释液，沸水浴5min，分别作为α-淀粉酶对照管和总淀粉酶对照管使用。 4.测定操作表：
混匀，沸水浴10min，取200uL至96孔板或微量玻璃比色皿中，在540nm下测定吸光度，从左到右分别记为A1、A2、A3、A4、A5和A6，计算ΔAa=A2-A1，ΔA总=A4-A3，ΔA标准=A5-A6。每个测定管需设一个对照管。标准曲线和空白管只需测1-2次。 四、酶活性计算 1.标准曲线的绘制 以标准液的浓度(mg/mL)为x轴，对应的ΔA标准为y轴，绘制标准曲线，得到标准方程y=kx+b，将ΔAa代入方程得到xi (mg/mL） ，ΔA总代入方程得到x2 (mg/mL) 。 2.α-淀粉酶活性的计算 (1）按照样本质量计算 单位定义：每g组织每分钟催化产生1mg还原糖定义为1个酶活力单位。 α-淀粉酶活性(U/g质量)=x1×V样÷(W×V样÷V样总)÷T (2）按照蛋白质含量计算 单位定义：每mg组织蛋白每分钟催化产生1mg还原糖定义为1个酶活性单位。 α-淀粉酶活性(U/mg prot)=x1×V样÷(V样×Cpr)÷T 3.总淀粉酶活性计算: (1）按照样本质量计算 单位定义：每g组织每分钟催化产生1mg还原糖定义为1个酶活力单位。 总淀粉酶活性(U/g质量)=5×x2×V样÷(W×V样÷V样总)÷T (2）按照蛋白质含量计算 单位定义：每mg组织蛋白每分钟催化产生1mg还原糖定义为1个酶活力单位。 总淀粉酶活性(U/mg prot)=5×x2×V样÷(V样×Cpr)÷T 4.β-淀粉酶活性计算: (1）按照样本质量计算 单位定义：每g组织在反应体系中每分钟催化产生1mg还原糖定义为1个酶活力单位。 β-淀粉酶活性（U/g质量)=淀粉酶总活性-α-淀粉酶活性=(10×x2÷W)-(2×x1÷W) (2）按照蛋白质含量计算 单位定义：每mg组织蛋白在反应体系中每分钟催化产生1mg还原糖定义为1个酶活力单位。 β-淀粉酶活性（U/mg prot）=淀粉酶总活性-α-淀粉酶活性=(x÷Cpr) - (0.2×x1÷Cpr) 5：总淀粉酶稀释倍数; V样：加入反应体系中样本体积; V样总：提取液总体积; Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL; W：样本质量，g; T:反应时间，5min。 注意事项: 测定的吸光值大于1.5时，可以对样本进行适当稀释后测定。若吸光值过小，可以浓缩淀粉酶稀释液或者淀粉酶原液。 本试剂盒仅供科研使用! |
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