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Cat. Number

HK21178-48S

Chemical Name

HK21178-48S α-酮戊二酸脱氢酶(α-KGDH)测试盒(紫外分光光度法)

Qty 1

50T/48S

References

α-酮戊二酸脱氢酶α-KGDH（EC 1.2.4.2）广泛存在于动物、植物微生物和培养细胞的线粒体中，是三羧酸循环调控关键酶之一，催化α-酮戊二酸氧化脱羧生成琥珀酰辅酶A。

测定原理：

α-KGDH催化α-酮戊二酸、NAD+ 和辅酶A生成琥珀酰辅酶A、二氧化碳和 NADH，NADH在340 nm有特征吸收峰，以NADH的生成速率表示α-KGDH活性。

需自备的仪器和用品：

紫外分光光度计、水浴锅/恒温培养箱、台式离心机、可调式移液器、1mL石英比色皿、研钵/匀浆器、冰和蒸馏水。

产品组成：

实验步骤：

注意：实验之前建议选择2-3 个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。

一、样本处理（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献）

称取约0.1g 组织或收集约500 万细胞，加入1mL 试剂R1和10μL 试剂R2，冰浴，用匀浆器或研钵充分研磨，4℃ 11000g 离心10min，取上清，置冰上待测。

二、试剂准备：

1．试剂R2：为易挥发试剂，用完后尽快密封，-20℃保存；

2．试剂R5：临用前取1 支试剂R5，加入1 mL 试剂R3，充分溶解，用不完的试剂2-8℃保存4 周；

3．试剂R6：临用前取1 支试剂R6，加入3 mL 试剂R3，充分溶解，用不完的试剂-20℃分装保存4 周，避免反复冻融；

4．试剂R7：临用前取1 支试剂R7，加入1.5 mL 试剂R3，充分溶解，用不完的试剂-20℃分装保存4 周，避免反复冻融（1 支粉剂溶解后可做100T，为了延长使用时间，此产品多给1 支粉剂）；

5．试剂R8：临用前取1 支试剂R8，加入1mL 蒸馏水，充分溶解，用不完的试剂-20℃分装保存4 周，避免反复冻融；

6．工作液的配制：临用前依次取22 mL 试剂R3、0.5 mL 试剂R4、1 mL 试剂R5、2.75 mL 试剂R6、1.25 mL试剂R7（共27.5mL，约27T），充分混合待用，现用现配。

三、操作步骤

1、紫外分光光度计预热30min以上，调节波长至340nm，需用蒸馏水调零。

2、操作表：1mL石英比色皿中依次加入：

试剂名称（uL）	空白管	测定管
工作液	1000	1000
空白管37℃孵育5min；样本在37℃（哺乳动物）或25℃（其它物种）孵育5min；
试剂R8	40	40
蒸馏水	60	-
样本	-	60
空白管：立即开始计时10s，混匀并立即测量340nm处10s的吸光值A1，37℃准确反应2min，记录340nm处2min10s时的吸光值A2，计算ΔA空白=A2-A1。空白管只需测1-2次。
测定管：立即开始计时10s，混匀并立即测量340nm处10s的吸光值A3，37℃（哺乳动物）或25℃（其它物种）中准确反应2min，记录340nm处2min10s时的吸光值A4，计算ΔA测定=A4-A3。