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Cat. Number
HK21172-24S
Chemical Name
HK21172-24S α-半乳糖苷酶(α-GAL)测试盒(可见分光光度法)
Qty 1
50T/24S
References

α-半乳糖苷酶α-GAL (EC 3.2.1.22)广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中,能专一地催化α半乳糖苷键的水解,主要参与棉子糖、水苏糖、蜜二糖和半乳甘露聚糖等半乳糖苷的降解。α-GAL对于植物种子的萌发至关重要,种子萌发初期,其催化产生的D-半乳糖通过糖酵解途径迅速转化和消耗,为种子的萌发提供最初的能量来源,后期则主要参与细胞壁储藏多糖水解。


测定原理:

α-GAL分解对-硝基苯-α-D-吡喃半乳糖苷生成对-硝基苯酚,后者在400nm有最大吸收峰,通过测定吸光值升高速率来计算α-GAL活性。


需自备的仪器和用品:

可见分光光度计、低温离心机、水浴锅/恒温培养箱、可调式移液器、超声破碎仪、1mL玻璃比色皿、研钵/匀浆器、冰和蒸馏水。


产品组成:

试剂名称规格保存条件
提取液液体×1 瓶2-8℃
试剂R1粉剂×2 支-20℃
试剂R2液体×1 瓶2-8℃
试剂R3液体×1 瓶2-8℃
标准品液体×1 瓶2-8℃


实验步骤:

注意:实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。

一、样本处理(可适当调整待测样本量,具体比例可以参考文献)

1、细菌或培养细胞的处理:收集细菌或细胞到离心管内,离心后弃上清;按照每500万细菌或细胞加入1mL提取液,超声波破碎细菌或细胞(功率200W,超声3,间隔10,重复30次),15000g,4℃,离心2Omin,取上清,置冰上待测。

2、组织的处理:称取约0.1g组织,加入lmL提取液进行冰浴匀浆;15000g,4℃,离心20min,取上清,置冰上待测。

二、试剂准备

1、试剂R1:临用前取1支加入2.67mL蒸馏水,充分溶解备用;用不完的试剂-20℃分装保存4周,避免反复冻融;

2、标准品:5 umol/mL的对硝基苯酚溶液。

三、测定步骤

1、分光光度计预热30min以上,调节波长至400nm,蒸馏水调零。

2、标准液的稀释:将标准液用蒸馏水稀释至200、100、50、25、12.5、6.25、0nmolmL标准溶液待测。

3、样本测定(在1.5mLEP管中依次加入下列试剂):

试剂名称(uL)测定管对照管标准管
试剂R1200--
蒸馏水-200-
试剂R2250250-
样本5050-
                                                 迅速混匀,放入37℃水浴锅/恒温培养箱中准确反应30min
标准品--500
试剂R3100010001000
充分混匀,室温静置2min后,于400nm处测定吸光值A,分别记为A测定管、A对照管、A标准管、A空白管。计算ΔA测定=A测定管-A对照管,ΔA标准=A标准管-A空白管。每个测定管需设一个对照管。标准曲线和空白管只需测1-2次。

四、a-GAL活性计算

1、标准曲线的建立:

根据标准管的吸光度(y,AA标准)和浓度(x, nmolmL)建立标准曲线,将AA (y,AA测定〉带入杯准曲线中,计算样本生成的产物量x (nmol/mL)。

2、a-GAL活性计算

(1)按样本蛋白浓度计算

单位的定义:每mg组织蛋白每小时产生1nmol对-硝基苯酚定义为一个酶活力单位。

a-GAL活力(U/mg prot)=(xxV反总)÷(V样×Cpr)÷T 

(2)按样本质量计算

单位的定义:每g组织每小时产生1nmol对-硝基苯酚定义为一个酶活力单位。

a-GAL活力(U/g质量)=(xxV反总)÷(WxV样÷V样总)÷T

(3)按细菌或细胞数量计算

单位的定义:每1万个细菌或细胞每小时产生1nmol对-硝基苯酚定义为一个酶活力单位。

a-GAL活力(U/104 cell)=(x×V反总)÷(500×V样÷V样总)÷T

Cpr:样本蛋白质浓度,mg/mL,蛋白浓度需要另外测定;

V反总:反应体系总体积;

V样:加入反应体系中样本体积;

V样总:加入提取液体积;

W:样本质量,g; 

500:细胞或细菌总数,500万;

T:;反应时间,0.5h。


注意事项:

提取液中含有使蛋白变性的成分,故按蛋白浓度计算时需要重新提取蛋白进行测定。


本试剂盒仅供科研使用!


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