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| Cat. Number | HK21167-96S |
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| Chemical Name | HK21167-96S NAD-苹果酸脱氢酶(NAD-MDH)测试盒(酶标板法) |
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| Qty 1 |
100T/96S |
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| References | 苹果酸脱氢酶MDH （EC 1.1.1.37）广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中，线粒体中MDH 是TCA循环的关键酶之一，催化苹果酸形成草酰乙酸；相反，胞浆中MDH 催化草酰乙酸形成苹果酸。草酰乙酸是重要的中间产物， 连接多条重要的代谢途径。因此，MDH 在细胞多种生理活动中扮演着重要的角色，包括线粒体的能量代谢、苹果酸-天冬氨酸穿梭系统、活性氧代谢和抗病性等。根据不同的辅酶特异性，MDH 分为NAD-依赖的MDH 和NADP-依赖的MDH，细菌中通常只含有NAD-MDH，在真核细胞中，NAD-MDH 分布于细胞质和线粒体中。
NAD-MDH 催化NADH 还原草酰乙酸生成苹果酸，导致340nm 处光吸收下降。 需自备的仪器和用品： 紫外分光光度计/酶标仪、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、微量石英比色皿/ 96 孔板（UV 板）、研钵/匀浆器、蒸馏水。 产品组成：
实验步骤： 注意：实验之前建议选择2-3 个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。 一、样本处理（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献） 细菌或培养细胞：收集细菌或细胞到离心管内，离心弃上清，按照每200 万细菌或细胞加入400μL 提取液，超声波破碎细菌或细胞（功率20%，超声3s，间隔10s，重复30 次），8000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。 组织：称取约0.05g 组织，加入1mL 提取液进行冰浴匀浆；8000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。 血清（浆）样本：直接检测。 二、试剂准备 1、试剂R2：临用前加入360 μL 双蒸水，用不完的试剂仍-20℃保存； 2、试剂R3：临用前加入327 μL 双蒸水，用不完的试剂仍-20℃保存。 三、测定步骤 1、紫外分光光度计/酶标仪提前预热30min，调节波长至340nm，蒸馏水调零。 2、试剂R1 37℃预热15min。 3、样本测定：
将上述试剂按顺序加入微量石英比色皿/96 孔UV 板中，充分吸打混匀后立即在340nm 波长下记录初始吸光度A1 和反应1min 后的吸光度A2，尽量保持反应温度为37℃。计算ΔA=A1-A2。记录ΔA 测定、ΔA 空白。（空白管测1-2 管即可） 四、NAD-MDH活力单位的计算 A：使用微量石英比色皿检测的计算公式如下 1．血清（浆）NAD-MDH活力的计算 单位的定义：每毫升血清（浆）在反应体系中每分钟消耗1nmol的NADH定义为一个酶活力单位。 NAD-MDH（U/mL）=(ΔA测定-ΔA空白)÷(ε×d)×V反总÷V样本÷T 2．组织中NAD-MDH活力的计算 （1）按样本蛋白浓度计算： 单位的定义：每mg组织蛋白在反应体系中每分钟消耗1nmol的NADH定义为一个酶活力单位。 NAD-MDH（U/mg prot）=(ΔA测定-ΔA空白)÷(ε×d)×V反总÷(V样本×Cpr)÷T （2）按样本质量计算： 单位的定义：每g组织在反应体系中每分钟消耗1nmol的NADH定义为一个酶活力单位。 NAD-MDH（U/g 质量）=(ΔA测定-ΔA空白)÷(ε×d)×V反总÷(W÷V提取×V样本)÷T 3．细菌或培养细胞中NAD-MDH活力的计算 （1）按样本蛋白浓度计算： 单位的定义：每mg组织蛋白在反应体系中每分钟消耗1nmol的NADH定义为一个酶活力单位。 NAD-MDH（U/mg prot）=(ΔA测定-ΔA空白)÷(ε×d)×V反总÷(V样本×Cpr)÷T （2）按细菌或细胞密度计算： 单位的定义：每1万个细菌或细胞在反应体系中每分钟消耗1nmol的NADH定义为一个酶活力单位。 NAD-MDH（U/104 cell）=(ΔA测定-ΔA空白)÷(ε×d)×V反总÷(500×V样本)÷T V反总：反应总体积； V样本：加入样本体积； V提取：提取液体积； ε：NADH摩尔消光系数，6.22×10-3mL/nmol/cm； d：比色皿光径，1cm； T：反应时间，1min； Cpr：样本蛋白浓度，mg/mL； 500：细菌或细胞密度，500万/mL； W：样本质量，g。 B：使用96孔UV板检测的计算公式如下 1. 血清（浆）NAD-MDH活力的计算 单位的定义：每毫升血清（浆）在反应体系中每分钟消耗1nmol的NADH定义为一个酶活力单位。 NAD-MDH（U/mL）=(ΔA测定-ΔA空白)÷(ε×d)×V反总÷V样本÷T 2. 组织中NAD-MDH活力的计算 （1）按样本蛋白浓度计算： 单位的定义：每mg组织蛋白在反应体系中每分钟消耗1nmol的NADH定义为一个酶活力单位。 NAD-MDH（U/mg prot）=(ΔA测定-ΔA空白)÷(ε×d)×V反总÷(V样本×Cpr)÷T （2）按样本质量计算： 单位的定义：每g组织在反应体系中每分钟消耗1nmol的NADH定义为一个酶活力单位。 NAD-MDH（U/g 质量）=(ΔA测定-ΔA空白)÷(ε×d)×V反总÷(W÷V提取×V样本)÷T 3. 细菌或培养细胞中NAD-MDH活力的计算 （1）按样本蛋白浓度计算： 单位的定义：每mg组织蛋白在反应体系中每分钟消耗1nmol的NADH定义为一个酶活力单位。 NAD-MDH（U/mg prot）=(ΔA测定-ΔA空白)÷(ε×d)×V反总÷(V样本×Cpr)÷T （2）按细菌或细胞密度计算： 单位的定义：每1万个细菌或细胞在反应体系中每分钟消耗1nmol的NADH定义为一个酶活力单位。 NAD-MDH（U/104 cell）=(ΔA测定-ΔA空白)÷(ε×d)×V反总÷(500×V样本)÷T V反总：反应总体积； V样本：加入样本体积； V提取：提取液体积； ε：NADH摩尔消光系数，6.22×10-3mL/nmol/cm； d：96孔UV板光径，0.6cm； T：反应时间，1min； Cpr：样本蛋白浓度，mg/mL； 500：细菌或细胞密度，500万/mL； W：样本质量，g。 注意事项： 1、粗酶液的提取必须在0℃-4℃中操做完成，以防止酶变性失活。 2、实验时，试剂R2、试剂R3和样本在冰上放置，以免变性和失活。 3、使用光径为1cm 的微量石英比色皿时当初始读值小于0.7 或者ΔA 大于0.5 时建议稀释后测量。使用96 孔UV板时当初始读值小于0.4 或者ΔA 大于0.3 时建议稀释后测量。 4、建议一人加样一人比色。因时间监测范围小，不推荐用96 孔UV 板同时测多个样本。 本试剂盒仅供科研使用! |
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