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Cat. Number
HK21167-96S
Chemical Name
HK21167-96S NAD-苹果酸脱氢酶(NAD-MDH)测试盒(酶标板法)
Qty 1
100T/96S
References

苹果酸脱氢酶MDH (EC 1.1.1.37)广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中,线粒体中MDH 是TCA循环的关键酶之一,催化苹果酸形成草酰乙酸;相反,胞浆中MDH 催化草酰乙酸形成苹果酸。草酰乙酸是重要的中间产物, 连接多条重要的代谢途径。因此,MDH 在细胞多种生理活动中扮演着重要的角色,包括线粒体的能量代谢、苹果酸-天冬氨酸穿梭系统、活性氧代谢和抗病性等。根据不同的辅酶特异性,MDH 分为NAD-依赖的MDH 和NADP-依赖的MDH,细菌中通常只含有NAD-MDH,在真核细胞中,NAD-MDH 分布于细胞质和线粒体中。


测定原理:

NAD-MDH 催化NADH 还原草酰乙酸生成苹果酸,导致340nm 处光吸收下降。


需自备的仪器和用品:

紫外分光光度计/酶标仪、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、微量石英比色皿/ 96 孔板(UV 板)、研钵/匀浆器、蒸馏水。


产品组成:

试剂名称规格保存条件
提取液液体×1 瓶2-8℃
试剂R1液体×1 瓶2-8℃
试剂R2粉剂×1 支-20℃
试剂R3粉剂×1 支-20℃


实验步骤:

注意:实验之前建议选择2-3 个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。

一、样本处理(可适当调整待测样本量,具体比例可以参考文献)

细菌或培养细胞:收集细菌或细胞到离心管内,离心弃上清,按照每200 万细菌或细胞加入400μL 提取液,超声波破碎细菌或细胞(功率20%,超声3s,间隔10s,重复30 次),8000g 4℃离心10min,取上清,置冰上待测。

组织:称取约0.05g 组织,加入1mL 提取液进行冰浴匀浆;8000g 4℃离心10min,取上清,置冰上待测。

血清(浆)样本:直接检测。

二、试剂准备

1、试剂R2:临用前加入360 μL 双蒸水,用不完的试剂仍-20℃保存;

2、试剂R3:临用前加入327 μL 双蒸水,用不完的试剂仍-20℃保存。

三、测定步骤

1、紫外分光光度计/酶标仪提前预热30min,调节波长至340nm,蒸馏水调零。

2、试剂R1 37℃预热15min。

3、样本测定:

试剂名称测定管空白管
样本5-
蒸馏水-5
试剂R1190190
试剂R22.52.5
试剂R32.52.5

将上述试剂按顺序加入微量石英比色皿/96 孔UV 板中,充分吸打混匀后立即在340nm 波长下记录初始吸光度A1 和反应1min 后的吸光度A2,尽量保持反应温度为37℃。计算ΔA=A1-A2。记录ΔA 测定、ΔA 空白。(空白管测1-2 管即可)

四、NAD-MDH活力单位的计算

A:使用微量石英比色皿检测的计算公式如下

1.血清(浆)NAD-MDH活力的计算

单位的定义:每毫升血清(浆)在反应体系中每分钟消耗1nmol的NADH定义为一个酶活力单位。

NAD-MDH(U/mL)=(ΔA测定-ΔA空白)÷(ε×d)×V反总÷V样本÷T

2.组织中NAD-MDH活力的计算

(1)按样本蛋白浓度计算:

单位的定义:每mg组织蛋白在反应体系中每分钟消耗1nmol的NADH定义为一个酶活力单位。

NAD-MDH(U/mg prot)=(ΔA测定-ΔA空白)÷(ε×d)×V反总÷(V样本×Cpr)÷T

(2)按样本质量计算:

单位的定义:每g组织在反应体系中每分钟消耗1nmol的NADH定义为一个酶活力单位。

NAD-MDH(U/g 质量)=(ΔA测定-ΔA空白)÷(ε×d)×V反总÷(W÷V提取×V样本)÷T

3.细菌或培养细胞中NAD-MDH活力的计算

(1)按样本蛋白浓度计算:

单位的定义:每mg组织蛋白在反应体系中每分钟消耗1nmol的NADH定义为一个酶活力单位。

NAD-MDH(U/mg prot)=(ΔA测定-ΔA空白)÷(ε×d)×V反总÷(V样本×Cpr)÷T

(2)按细菌或细胞密度计算:

单位的定义:每1万个细菌或细胞在反应体系中每分钟消耗1nmol的NADH定义为一个酶活力单位。

NAD-MDH(U/104 cell)=(ΔA测定-ΔA空白)÷(ε×d)×V反总÷(500×V样本)÷T 

V反总:反应总体积;

V样本:加入样本体积;

V提取:提取液体积;

ε:NADH摩尔消光系数,6.22×10-3mL/nmol/cm;

d:比色皿光径,1cm;

T:反应时间,1min;

Cpr:样本蛋白浓度,mg/mL;

500:细菌或细胞密度,500万/mL;

W:样本质量,g。

B:使用96孔UV板检测的计算公式如下

1. 血清(浆)NAD-MDH活力的计算

单位的定义:每毫升血清(浆)在反应体系中每分钟消耗1nmol的NADH定义为一个酶活力单位。

NAD-MDH(U/mL)=(ΔA测定-ΔA空白)÷(ε×d)×V反总÷V样本÷T

2. 组织中NAD-MDH活力的计算

(1)按样本蛋白浓度计算:

单位的定义:每mg组织蛋白在反应体系中每分钟消耗1nmol的NADH定义为一个酶活力单位。

NAD-MDH(U/mg prot)=(ΔA测定-ΔA空白)÷(ε×d)×V反总÷(V样本×Cpr)÷T

(2)按样本质量计算:

单位的定义:每g组织在反应体系中每分钟消耗1nmol的NADH定义为一个酶活力单位。

NAD-MDH(U/g 质量)=(ΔA测定-ΔA空白)÷(ε×d)×V反总÷(W÷V提取×V样本)÷T

3. 细菌或培养细胞中NAD-MDH活力的计算

(1)按样本蛋白浓度计算:

单位的定义:每mg组织蛋白在反应体系中每分钟消耗1nmol的NADH定义为一个酶活力单位。

NAD-MDH(U/mg prot)=(ΔA测定-ΔA空白)÷(ε×d)×V反总÷(V样本×Cpr)÷T

(2)按细菌或细胞密度计算:

单位的定义:每1万个细菌或细胞在反应体系中每分钟消耗1nmol的NADH定义为一个酶活力单位。

NAD-MDH(U/104 cell)=(ΔA测定-ΔA空白)÷(ε×d)×V反总÷(500×V样本)÷T

V反总:反应总体积;

V样本:加入样本体积;

V提取:提取液体积;

ε:NADH摩尔消光系数,6.22×10-3mL/nmol/cm;

d:96孔UV板光径,0.6cm;

T:反应时间,1min;

Cpr:样本蛋白浓度,mg/mL;

500:细菌或细胞密度,500万/mL;

W:样本质量,g。


注意事项:

1、粗酶液的提取必须在0℃-4℃中操做完成,以防止酶变性失活。

2、实验时,试剂R2、试剂R3和样本在冰上放置,以免变性和失活。

3、使用光径为1cm 的微量石英比色皿时当初始读值小于0.7 或者ΔA 大于0.5 时建议稀释后测量。使用96 孔UV板时当初始读值小于0.4 或者ΔA 大于0.3 时建议稀释后测量。

4、建议一人加样一人比色。因时间监测范围小,不推荐用96 孔UV 板同时测多个样本。


本试剂盒仅供科研使用!

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