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Cat. Number
HK21165-96S
Chemical Name
HK21165-96S NAD-苹果酸酶(NAD-ME)测试盒(酶标板法)
Qty 1
100T/96S
References

NAD-苹果酸酶(NAD-ME)广泛存在于微生物、培养细胞、动物和植物胞浆中,尤其在植物组织中活性较高。ME催化苹果酸氧化脱羧的可逆反应,产生丙酮酸和CO2,以及伴随NAD(P)+的还原反应,是苹果酸代谢的关键酶。ME活性与生物合成和抗氧化密切相关。近年来植物ME活性测定较多,已经成为抗氧化研究的热点。根据辅酶专一性和对底物特异性的不同,可将ME分为NAD-ME(EC1.1.1.38)和NADP-ME(EC1.1.1.40)。


测定原理:

NADP-ME催化NADP+还原成NADPH,在340nm下测定NADPH增加速率。


需自备的仪器和用品:

紫外分光光度计/酶标仪、低温离心机、水浴锅、可调节移液器、微量石英比色皿/96孔UV板、研钵/匀浆器、蒸馏水。


产品组成:

试剂名称规格保存条件
提取液液体×1 瓶4℃
试剂R1液体×1 瓶4℃
试剂R2粉剂×1 瓶4℃
试剂R3粉剂×1 支4℃
试剂R4粉剂×1 支-20℃


实验步骤:

注意:实验之前建议选择2-3 个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。

一、样本处理(可适当调整待测样本量,具体比例可以参考文献)

1、细菌、细胞或组织样本的制备:

细菌或培养细胞:先收集细菌或细胞到离心管内,弃上清,按照每500 万细菌或细胞加入1mL 提取液,超声波破碎细菌或细胞(功率20%,超声3s,间隔10s,重复30 次)。8000g 4℃离心10min,取上清,置冰上待测。

组织:称取约0.1g 组织,加入1mL 提取液进行冰浴匀浆。8000g 4℃离心10min,取上清,置冰上待测。

2、血清(浆)样本:直接检测。

二、试剂准备

1、试剂R2:临用前加入10 mL 提取液充分溶解备用;

2、试剂R3:临用前每支加1 mL 双蒸水充分溶解备用;

3、试剂R4:用时每支加500 μL 双蒸水充分溶解备用;

4、工作液:在7.5 mL 试剂R2中加入1 mL 试剂R3和0.5 mL 试剂R4,可以根据比例现用现配。

三、测定步骤

1、紫外分光光度计/酶标仪预热30min以上,调节波长至340nm,蒸馏水调零。

2、将试剂R1在37℃(哺乳动物)或25℃(其它物种)中保温15min左右。

3、操作表:

试剂名称(uL)

测定管
试剂R1200
工作液90
样本10

将上述试剂按顺序加入微量石英比色皿/96 孔UV 板中混匀,在37℃(哺乳动物)或25℃(其它物种),340nm波长下记录初始吸光度A1 和反应5min 后的吸光度A2,计算ΔA=A2-A1。

四、NAD-ME 活性计算

a.用微量石英比色皿测定的计算公式如下

1、组织中NAD-ME活力的计算:

(1)按样本蛋白浓度计算:

单位的定义:每mg组织蛋白在反应体系中每分钟生成1nmol NADH定义为一个酶活力单位。

NAD-ME(U/mg prot)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×109]÷(Cpr×V样) ÷T

(2)按样本质量计算:

单位的定义:每g组织在反应体系中每分钟生成1nmol NADH定义为一个酶活力单位。

NAD-ME(U/g 质量)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×109]÷(V样÷V样总×W) ÷T 

2、细菌或细胞中NAD-ME活力的计算:

(1)按样本蛋白浓度计算:

单位的定义:每mg组织蛋白在反应体系中每分钟生成1nmol NADH定义为一个酶活力单位。

NAD-ME(U/mg prot)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×109]÷(Cpr×V样) ÷T

(2)按细菌或细胞数量计算:

单位的定义:每1万个细菌或细胞在反应体系中每分钟生成1nmol NADH定义为一个酶活力单位。

NAD-ME(U/104 cell)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×109]÷(V样÷V样总×500) ÷T

3、血清中NAD-ME活力的计算:

单位的定义:每mL血清在反应体系中每分钟生成1 nmol NADH定义为一个酶活力单位。

NAD-ME(U/mL)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×109]÷V样÷T 

V反总:反应体系总体积;

ε:NADH摩尔消光系数,6.22×103 L/mol/cm;

d:比色皿光径,1cm;

V样:加入样本体积;

V样总:加入提取液体积;

T:反应时间,5min;

Cpr:样本蛋白质浓度,mg/mL;

W:样本质量,g;

500:细菌或细胞总数,500万;

109:单位换算系数,1mol=109nmol。

b.用96孔板测定的计算公式

将上述公式中的d-1cm改为d-0.6cm进行计算。


注意事项:

1、若A2-A1大于0.5,需将样本用提取液稀释,使A2-A1小于0.5,可提高检测灵敏度。

2、实验时,样本在冰上放置,以免变性和失活。试剂一37℃或25℃水浴放置。

3、比色皿中反应液的温度必须保持37℃或25℃,取小烧杯一只装入一定量的37℃或25℃蒸馏水,将此烧杯放入37℃或25℃水浴锅中。在反应过程中把比色皿连同反应液放在此烧杯中。用96孔板做时尽量保持反应温度在37℃或25℃。

4、最好两个人同时做此实验,一个人比色,一个人计时,以保证实验结果的准确性。用96孔板做时尽量做到样本反应时间一致。

5、如果ΔA<0.01,可将反应时间延长到10分钟。


本试剂盒仅供科研使用!

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