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| Cat. Number | HK21165-96S |
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| Chemical Name | HK21165-96S NAD-苹果酸酶(NAD-ME)测试盒(酶标板法) |
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| Qty 1 |
100T/96S |
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| References | NAD-苹果酸酶(NAD-ME)广泛存在于微生物、培养细胞、动物和植物胞浆中，尤其在植物组织中活性较高。ME催化苹果酸氧化脱羧的可逆反应，产生丙酮酸和CO2，以及伴随NAD(P)+的还原反应，是苹果酸代谢的关键酶。ME活性与生物合成和抗氧化密切相关。近年来植物ME活性测定较多，已经成为抗氧化研究的热点。根据辅酶专一性和对底物特异性的不同，可将ME分为NAD-ME(EC1.1.1.38)和NADP-ME(EC1.1.1.40)。 测定原理： NADP-ME催化NADP+还原成NADPH，在340nm下测定NADPH增加速率。 需自备的仪器和用品： 紫外分光光度计/酶标仪、低温离心机、水浴锅、可调节移液器、微量石英比色皿/96孔UV板、研钵/匀浆器、蒸馏水。 产品组成：
实验步骤： 注意：实验之前建议选择2-3 个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。 一、样本处理（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献） 1、细菌、细胞或组织样本的制备： 细菌或培养细胞：先收集细菌或细胞到离心管内，弃上清，按照每500 万细菌或细胞加入1mL 提取液，超声波破碎细菌或细胞（功率20%，超声3s，间隔10s，重复30 次）。8000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。 组织：称取约0.1g 组织，加入1mL 提取液进行冰浴匀浆。8000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。 2、血清（浆）样本：直接检测。 二、试剂准备 1、试剂R2：临用前加入10 mL 提取液充分溶解备用； 2、试剂R3：临用前每支加1 mL 双蒸水充分溶解备用； 3、试剂R4：用时每支加500 μL 双蒸水充分溶解备用； 4、工作液：在7.5 mL 试剂R2中加入1 mL 试剂R3和0.5 mL 试剂R4，可以根据比例现用现配。 三、测定步骤 1、紫外分光光度计/酶标仪预热30min以上，调节波长至340nm，蒸馏水调零。 2、将试剂R1在37℃（哺乳动物）或25℃（其它物种）中保温15min左右。 3、操作表：
将上述试剂按顺序加入微量石英比色皿/96 孔UV 板中混匀，在37℃（哺乳动物）或25℃（其它物种），340nm波长下记录初始吸光度A1 和反应5min 后的吸光度A2，计算ΔA=A2-A1。 四、NAD-ME 活性计算 a.用微量石英比色皿测定的计算公式如下 1、组织中NAD-ME活力的计算： （1）按样本蛋白浓度计算： 单位的定义：每mg组织蛋白在反应体系中每分钟生成1nmol NADH定义为一个酶活力单位。 NAD-ME（U/mg prot）=[ΔA×V反总÷（ε×d）×109]÷(Cpr×V样) ÷T （2）按样本质量计算： 单位的定义：每g组织在反应体系中每分钟生成1nmol NADH定义为一个酶活力单位。 NAD-ME（U/g 质量）=[ΔA×V反总÷（ε×d）×109]÷(V样÷V样总×W) ÷T 2、细菌或细胞中NAD-ME活力的计算： （1）按样本蛋白浓度计算： 单位的定义：每mg组织蛋白在反应体系中每分钟生成1nmol NADH定义为一个酶活力单位。 NAD-ME（U/mg prot）=[ΔA×V反总÷（ε×d）×109]÷(Cpr×V样) ÷T （2）按细菌或细胞数量计算： 单位的定义：每1万个细菌或细胞在反应体系中每分钟生成1nmol NADH定义为一个酶活力单位。 NAD-ME（U/104 cell）=[ΔA×V反总÷（ε×d）×109]÷(V样÷V样总×500) ÷T 3、血清中NAD-ME活力的计算： 单位的定义：每mL血清在反应体系中每分钟生成1 nmol NADH定义为一个酶活力单位。 NAD-ME（U/mL）=[ΔA×V反总÷（ε×d）×109]÷V样÷T V反总：反应体系总体积； ε：NADH摩尔消光系数，6.22×103 L/mol/cm； d：比色皿光径，1cm； V样：加入样本体积； V样总：加入提取液体积； T：反应时间，5min； Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL； W：样本质量，g； 500：细菌或细胞总数，500万； 109：单位换算系数，1mol=109nmol。 b.用96孔板测定的计算公式 将上述公式中的d-1cm改为d-0.6cm进行计算。 注意事项： 1、若A2-A1大于0.5，需将样本用提取液稀释，使A2-A1小于0.5，可提高检测灵敏度。 2、实验时，样本在冰上放置，以免变性和失活。试剂一37℃或25℃水浴放置。 3、比色皿中反应液的温度必须保持37℃或25℃，取小烧杯一只装入一定量的37℃或25℃蒸馏水，将此烧杯放入37℃或25℃水浴锅中。在反应过程中把比色皿连同反应液放在此烧杯中。用96孔板做时尽量保持反应温度在37℃或25℃。 4、最好两个人同时做此实验，一个人比色，一个人计时，以保证实验结果的准确性。用96孔板做时尽量做到样本反应时间一致。 5、如果ΔA＜0.01，可将反应时间延长到10分钟。 本试剂盒仅供科研使用! |
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