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| Cat. Number | HK21243-96S |
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| Chemical Name | HK21243-96S 二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶(Rubisco)测试盒(酶标板法) |
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| Qty 1 |
100T/96S |
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| References | 1,5-二磷酸核酮糖羧化/加氧酶（Rubisco, EC 4.1.1.39）是植物光合作用中的一个关键酶，既控制着CO2的固定，同时又制约着碳素向Calvin循环和光呼吸循环分流，其活性的大小直接影响着光合速率。 测定原理： 在Rubisco的催化下，1分子的核酮糖-1,5-二磷酸（RuBP）与1分子的CO2结合，产生2分子的3-磷酸甘油酸（PGA）；PGA可通过外加的3-磷酸甘油酸激酶和甘油醛-3-磷酸脱氢酶的作用，产生甘油醛-3-磷酸，伴随着NADH氧化生成NAD+；在340 nm NADH有特征吸收峰，而NAD+没有此吸收峰，因此测定340nm吸光度下降速率可以代表Rubisco的羧化酶活性。 需自备的仪器和用品： 紫外分光光度计/酶标仪、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、微量石英比色皿/96孔UV板、研钵/匀浆器、冰和蒸馏水。 产品组成：
实验步骤： 注意：实验之前建议选择2-3 个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。 一、样本处理（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献） 1、细菌或细胞样本的制备：收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照每500 万细菌或细胞加入1mL 提取液，超声波破碎细菌或细胞（功率20%，超声3s，间隔10s，重复30 次）；10000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。 2、称取约0.1g 组织加入1mL 提取液，冰浴中匀浆。10000g，4℃离心10min，取上清，置冰上待测。建议选取新鲜的植物样本。 二、试剂准备 1、试剂R3：临用前加入0.5 mL 蒸馏水充分溶解待用，振荡溶解后若出现浑浊可以离心使用； 2、试剂R4：临用前加入1 mL 蒸馏水充分溶解待用； 3、工作液的配制：临用前在试剂R2中加入全部试剂R1，充分混匀，在25℃孵育5min。 三、测定步骤 1、分光光度计/酶标仪预热30min 以上，调节波长至340nm，蒸馏水调零。 2、按下表步骤加样：
记录340nm 处20s 时吸光值A1 和5min20s 时的吸光值A2，计算ΔA 测定=A1 测定-A2 测定，ΔA 空白=A1空白-A2 空白，ΔA =ΔA 测定-ΔA 空白。反应温度保持在25℃。（空白管只做1-2 管） 四、Rubisco 活性计算 a.使用微量石英比色皿测定的计算公式如下： 1. 按样本蛋白浓度计算 单位的定义：25℃中每毫克蛋白每分钟氧化1nmol NADH为一个酶活力单位。 Rubisco活力（U/mg prot）=[ΔA×V反总÷（ε×d）×109]÷(Cpr×V样) ÷T 2. 按样本质量计算 单位的定义：25℃中每 g 组织每分钟氧化1nmol NADH为一个酶活力单位。 Rubisco活力（U/g 质量）=[ΔA×V反总÷（ε×d）×109]÷(V样÷V样总×W) ÷T 3. 按细菌或细胞数量计算 单位的定义：25℃中每1万个细菌或细胞每分钟氧化1nmol NADH为一个酶活力单位。 Rubisco活力（U/104 cell）=[ΔA×V反总÷（ε×d）×109]÷(V样÷V样总×500) ÷T V反总：反应体系总体积，2.14×10-4L； ε：NADH摩尔消光系数，6.22×103L/mol/cm； d：比色皿光径，1cm； V样：加入样本体积； V样总：加入提取液体积； T：反应时间，5min； W：样本质量，g； 500：细胞或细菌总数，500万； 109：单位换算系数，1mol=109nmol。 b.使用96孔板测定的计算公式如下： 将上述公式中光径d-1cm改为d-0.6cm（96孔板光径）进行计算。 本试剂盒仅供科研使用! |
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